【摘要】：梨銹水病是一種由細菌引起的病害,1973年在江蘇省北部區(qū)域,部分梨樹出現(xiàn)了主干流出鐵銹色的粘性液體的病癥,發(fā)病梨樹輕則落葉減產(chǎn)重則整株枯死,給果農(nóng)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。經(jīng)采樣分析后發(fā)現(xiàn)這是一種從未被報道過的細菌病害。發(fā)病梨樹的主要癥狀主要是在枝干上產(chǎn)生帶有酒糟氣味的鐵銹色粘液,故而取名“梨銹水病”,近年來梨銹水病在浙江、山東、德州也時常發(fā)生。經(jīng)本實驗室鑒定,梨銹水病原菌為迪基氏茵(Dickeya)屬下的一個未報道的種,本實驗室將其命名為方中達迪基氏菌D.fangzhongdaisp.nov.。在植物檢疫方面,梨銹水病的發(fā)病癥狀與檢疫性病害梨枯枝病類似,通過傳統(tǒng)的檢測技術(shù)難以區(qū)分。并且由于梨銹水病原菌是一種新的病原菌,目前國內(nèi)還沒有建立對其的分子檢測技術(shù),因此本實驗旨在通過普通PCR、實時熒光定量PCR的方法,建立梨銹水病原菌的分子檢測方法,能夠?qū)驿P水病菌進行快速準確的檢測,對病害的防治做出有益貢獻。首先,本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)中的Blast比對方法將梨銹水病原菌與其他13種近緣菌進行全基因組對比,篩選出10個具有特異性位點的同源基因,并針對這些具有特異性位點的基因片段設(shè)計引物,進行PCR擴增驗證。其次,對于10對設(shè)計好的引物進行PCR的驗證,篩選出兩對特異性強、靈敏度高的引物,分別是根據(jù)胞外多糖基因cpsB以及hrp基因簇hrpV基因設(shè)計的特異性引物。這兩對引物只能擴增梨銹水菌的特異性片段,對其屬內(nèi)的其他菌種及部分遠緣細菌均無條帶生成說明其高度的特異性,并且靈敏度可達10 pg/μL。以此建立了梨銹水病的PCR的檢測方法。最后,設(shè)計了以同源基因hrpV同源基因為靶標的特異性TaqMan探針和引物,建立了梨銹水病原菌的實時熒光定量檢測方法。檢測靈敏度可達20copies/μL,是普通PCR檢測方法的100倍,在一個小時內(nèi)就可以完成檢測。本研究建立的普通PCR檢測方法方便快捷,且成本低廉。熒光定量PCR方法靈敏度更高,用時更短,二者均能較好地將梨銹水病菌和其他迪基氏菌種區(qū)分,填補了梨銹水病分子檢測的空白,為檢測梨銹水病提供了新的方法。丁香假單胞菌黃瓜致病變種(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)引起的黃瓜細菌性角斑病在世界范圍內(nèi)皆有發(fā)生,造成不同程度的損失,同時也引起甜瓜細菌性葉斑病。以往研究表明黃瓜和甜瓜細菌性角斑病的病原均為丁香假單胞菌黃瓜致病變種,但在本實驗室的研究中發(fā)現(xiàn),丁香假單胞菌黃瓜致病變種黃瓜株系和甜瓜株系在致病性和分子生物學(xué)上存在一定差異。本研究利用Biolog細菌鑒定系統(tǒng)對黃瓜細菌性角斑病菌黃瓜株系和甜瓜株系的碳代謝活力分別進行了測定與比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),丁香假單胞菌黃瓜株系和甜瓜株系屬于不同的基因種。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.612.1
【圖文】：

會發(fā)射熒光信號，通過監(jiān)測熒光信號便能知道目的產(chǎn)物的生成量。第二種是ＲｇＭａｎ探針法，這種方法是建立在熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理上的（Ｃｌｅｇｇ，邋１９９５）。這種方法的心是設(shè)計一條特異的熒光探針，熒光探針是一條含有特異性位點的２０－３０ｂｐ的寡核酸，其退火溫度略高于引物，在探針的５’端添加報告熒光基團，３’端添加淬滅熒基團。當反應(yīng)開始時，；Ｔ＾Ｍａｎ探針是完整的，探針５’端添加的熒光基團發(fā)射的熒信號被３’端的淬滅熒光基團吸收，此時沒有熒光信號的產(chǎn)生。在反應(yīng)進行過程中７１＾酶會水解ｒ＾Ｍａｎ探針，使得報告熒光基團游離在體系之中，淬滅熒光基團無法吸其發(fā)出的熒光信號，此時儀器便能實時監(jiān)測到反應(yīng)中的熒光信號。兩種實時熒光定ＰＣＲ的方法各有利弊，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ邋Ｉ法成本較低，但耗時較長，７ｌ＾Ｍａｎ探針法的光探針制作成本較高，還有添加ＭＧＢ基團以增加熱穩(wěn)定性的７ｉ＾Ｍａｎ邋ＭＧＢ探針，往往在一個小時內(nèi)就能完成檢測，目前此方法在植物檢測病害方面也得到了許多應(yīng)逡逑用。初次將熒光定量ＰＣＲ方法引入應(yīng)用于植物病害檢測領(lǐng)域的是Ｂｏｈｍ等（１９９９），邋２００年有學(xué)者首次運用熒光定量ＰＣＲ方法檢測了真菌植物病害（Ｒｅｉｄ，２０００）。在中國，運逡逑用熒光定量技術(shù)對對植物病原微生物進行定量分析的時間還不長，程穎慧等（２００２）立了小麥印度腥黑穗病菌的實時熒光定量檢測技術(shù)。逡逑ＴａｑＩＶｌａｎ＇＊邐＿逡逑＇

３．２鎖式探針技術(shù)（Ｐａｄｌｏｃｋ）逡逑環(huán)狀寡核苷酸探針即鎖式探針，己經(jīng)證明在基因檢測中有廣泛的應(yīng)用價值，包括逡逑原位分析、基因分型和基因表達的測量等（Ａｎｔｓｏｎ，邋２０００）�，嵤教结槞z測技術(shù)是一種以逡逑連接酶介導(dǎo)的分子檢測技術(shù)（Ｎｉｌｓｓｏｎ邋ｅｔａｌ．，邋１９９４）。鎖式探針（ＰＬＰｓ）是一段長的核苷酸逡逑鏈，探針的末端與目標序列互補。在與目標序列雜交后，探針的兩端接觸，通過連接逡逑使探針環(huán)化。探針有非常特異的靶標識別位點，緊接著的是普通的ＰＣＲ擴增和斑點逡逑雜交（Ｓｚｅｍｅｓ，２００５）。成環(huán)的探針會在ＰＣＲ中被成倍擴增，斑點雜交后會出現(xiàn)顏色反逡逑應(yīng)，而未能與目標基因配對的探針會被外切酶降解。以此可以判斷待測樣品中是否存逡逑在目標病原菌。鎖式探針技術(shù)最大的優(yōu)點是可以檢測出單堿基的差異，大大減輕了探逡逑針與引物設(shè)計的難度，而且其靈敏度也較高。劉達等（２０１３）利用瑣式探針技術(shù)檢測瓜逡逑蔓枯病菌，檢測靈敏度可達２００邋ｆｇ是常規(guī)ＰＣＲ檢測靈敏度的１００倍，完全滿足了曰逡逑常檢疫工作中的要求。陳艷鴻等（２０１５）以ＤＮＡ復(fù)制和修復(fù)蛋白基因為靶標，建立了基逡逑于鎖式探針結(jié)合正向斑點雜交技術(shù)的地毯草黃單胞菌大豆致病變種檢測體系檢測靈逡逑敏度達到ｌＯＯｆｇ／ｐＬ。逡逑

邐梨銹水病的分子檢測技術(shù)研究邐逡逑光顯色即可完成檢測。其檢測靈敏度為２０邋ｃｆｏ／ｍＬ。該方法為西瓜嗜酸菌的檢疫及其逡逑所致病害的快速診斷提供了新的技術(shù)。逡逑

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本文編號：2753529