【摘要】：枇杷是一種亞熱帶常綠果樹,屬于薔薇科,蘋果亞科植物。自交不親和是一種普遍的遺傳控制機(jī)制,廣泛存在于被子植物中,它可以促使花柱拒絕自身的花粉,從而阻止近親繁殖。自交不親和受單一位點(diǎn)上(S-locus)的復(fù)等位基因(S-allele)控制,但在不同植物中的遺傳控制機(jī)制并不一致。主要分為配子體自交不親和與孢子體自交不親和。枇杷與蘋果,梨相同,屬于典型的配子體自交不親和樹種。然而,就目前而言,對于枇杷自交不親和的研究相對較少。本文通過已知的9個枇杷S-RNase基因,設(shè)計(jì)了 9對擴(kuò)增S基因的特異性引物,建立了 S等位基因特異性擴(kuò)增體系,利用這9對引物首次鑒定了 28個枇杷品種的基因型,重新鑒定了 11個已知基因型的枇杷品種的基因型;此外,對親和枇杷品種'早黃'枇杷進(jìn)行了自交親和機(jī)制的初步研究;擴(kuò)增了部分枇杷品種的花粉SFB基因,對其進(jìn)行了進(jìn)化分析。主要研究結(jié)果如下:1、根據(jù)已經(jīng)鑒定的13個枇杷S-RNase基因,選擇其中9個S-RNase基因(S2-RNase,S6-RNase,S7-RNase,S8-RNase,S9-RNase,S10-RNase,S11-RNase,S12-RNase,S13-RNase),并基于這9個S-RNase的序列設(shè)計(jì)了相對應(yīng)的9對S等位基因特異性引物。利用已知基因型的8個枇杷品種對設(shè)計(jì)的9對引物進(jìn)行了特異性的檢測,發(fā)現(xiàn)這9對引物均能擴(kuò)增出相應(yīng)的S-RNase,成功的建立了 S等位基因特異性擴(kuò)增體系。并且利用這9對引物首次鑒定了 28個枇杷品種的基因型,對之前研究過的11個品種的基因型進(jìn)行了重新鑒定。將本研究中鑒定的11個枇杷品種的基因型與之前鑒定的結(jié)果相比較,發(fā)現(xiàn)這11個品種中有8個品種的基因型與之前研究中的鑒定結(jié)果一致,進(jìn)一步的證明了 9對特異性引物能夠有效且特異的擴(kuò)增相應(yīng)S-RNase基因,并且能夠被用來快速鑒定含有這9個S-RNase基因的枇杷品種的基因型。2、在已知'早黃'枇杷和'白玉'枇杷的基因型(S2S10)一致的情況下,通過4組田間授粉實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn):'早黃'枇杷自交,有子代產(chǎn)生:'白玉'枇杷自交,沒有子代產(chǎn)生;在以'早黃'為父本,'白玉'為母本時,有子代產(chǎn)生,而以'早黃'為母本,'白玉'為父本時,有子代產(chǎn)生,我們確定了'早黃'枇杷為自交親和品種,'白玉'枇杷為自交不親和品種,且'早黃'枇杷自交親和的發(fā)生與花柱和花粉的S基因有關(guān)。然后,根據(jù)克隆的S2-RNase與S10-RNase基因的部分序列,設(shè)計(jì)了兩對熒光引物,對這兩個枇杷品種中S2-RNase基因與S10-RNase基因表達(dá)量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)'早黃'枇杷中S10-RNase基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于'白玉'枇杷中S10-RNase基因的表達(dá)量。進(jìn)一步的,利用Tail PCR對了兩個枇杷品種中S10-RNase基因的全長和啟動子進(jìn)行了克隆。通過序列比對后發(fā)現(xiàn),兩個枇杷品種的的S10-RNase基因的編碼區(qū)及內(nèi)含子區(qū)的序列完全一致。然而,與'白玉'枇杷不同的是,在'早黃'枇杷中S10-RNase基因的啟動子在ATG上游1755bp的位置缺失了 52個bp的堿基序列�；谏鲜鼋Y(jié)果,我們推測,'早黃'枇杷之所以表現(xiàn)為自交親和是由于花柱S10-RNase基因的啟動子失去了的功能,無法啟動S10-RNase基因的表達(dá),致使S10-RNase喪失了識別并降解自身花粉RNA的功能。3、利用已知的擴(kuò)增枇杷花粉SFB基因的引物D-SFBF1和D-SFBR1,對8個枇杷品種花粉SFB基因進(jìn)行克隆和測序分析,成功獲得了 8個新的SFB基因(SFB13～SFB20)。測序結(jié)果表明,枇杷與李屬植物不同(一個品種只含有2個SFB基因),一個品種的枇杷含有多個不同的SFB基因,且SFB基因的序列相似性較S-RNase基因來說較高,更為保守。不同SFB基因在不同的品種中存在的頻率存在較大差異,其中SFB2出現(xiàn)在了 6個枇杷品種中,SFB20只出現(xiàn)在'寧海白'枇杷中。將得到的8個新的SFB基因進(jìn)行蛋白質(zhì)功能分析,發(fā)現(xiàn)花粉SFB蛋白主要是參與氨基酸的生物合成,合成輔助因子,脂肪酸代謝,且SFB13,SFB17,SFB20均具有裂解酶的功能。經(jīng)過同源性分析,進(jìn)化樹構(gòu)建之后,發(fā)現(xiàn)枇杷的SFB基因主要分為三大類,其中第Ⅲ類SFB基因與第Ⅱ類SFB基因的同源性較高,而第Ⅰ類中的SFB基因同源性較低,為69%。根據(jù)這些結(jié)果,推測出在枇杷屬植物中可能由多個SFB基因一起控制花粉S決定因子的特異性,協(xié)同識別非自我的S-RNase基因。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S667.3
【圖文】：

圖２－１邋９對特異引物在基因中的相對位置。左邊為Ｓ等位基因的名稱和ＰＣＲ擴(kuò)增片段的逡逑長度，箭頭的位置為引物結(jié)合的位置。逡逑Ｆｉｇ２－１．邋Ｔｈｅ邋ｌｏｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋９邋ａｌｌｅｌｅ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｐｒｉｍｅｒ邋ｐａｉｒｓ．邋Ｔｈｅ邋ｎａｍｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｓ邋ａｌｌｅｌｅ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｃｔｅｄ邋ｓｉｚｅｓ邋ｏｆ逡逑ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ．邋Ｐｒｉｍｅｒ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｓｉｔｅｓ邋ａｒｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｄ邋ｂｙ邋ａｒｒｏｗ邋ｈｅａｄｓ．逡逑

利用８個已知基因型的枇杷品種（附表２－２邋）來檢驗(yàn)９對Ｓ等位基因特異性引物的逡逑特異性。由于不同引物對的ＧＣ含量不同，因而在ＰＣＲ擴(kuò)增時，對應(yīng)的退火溫度也不逡逑同，范圍在５６°Ｃ￣６２°Ｃ之間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（如圖２－２）：逡逑（１）邐ＥｐｆＦ／Ｒ在退火溫度為５８°Ｃ時，只在‘白玉’枇杷（Ｗｆｌ）中能擴(kuò)增出對逡逑應(yīng)的片段，大小為４１７ｂｐ，而在其他的枇杷品種中沒有擴(kuò)增出條帶；逡逑（２）邋ＥｐＳ＾Ｆ／Ｒ在退火溫度為５８°Ｃ時，在‘紅燈籠’邋（５＾）和美國種中逡逑獲得了正確的片段，大小為２２２ｂｐ，且沒有非特異條帶的出現(xiàn)，而在其他品種中沒有逡逑擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶；逡逑（３）邐ＥｐｆＦ／Ｒ在退火溫度達(dá)到６２°Ｃ時，成功的在‘冰糖種’邋（Ｓ３＂）和‘青種’逡逑（Ｗ３）中擴(kuò)增出大小為２４７ｂｐ的片段，且條帶單一。在其他品種中沒有得到條帶；逡逑（４）邐Ｅｐ５？Ｆ／Ｒ在退火溫度為５８°Ｃ時，在以８個枇杷品種的ＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ逡逑擴(kuò)增后

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