【摘要】：紅花草莓(Red-flowered strawberry)是草莓家族的新成員,為屬間雜種,其紅花性狀是由開紅花的沼委陵菜(Potentilla palustris)利用遠(yuǎn)緣雜交的方式導(dǎo)入至白花栽培草莓(Fragaria×ananassa)中去的。相比傳統(tǒng)栽培草莓而言,紅花草莓不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,而且具有良好的觀賞價(jià)值。其花紅果艷,能夠應(yīng)用于園林綠化和盆栽觀賞,是一種新型的兼具觀賞和食用的草莓,具有很好的發(fā)展?jié)摿�。花青素苷是紅花草莓得以呈現(xiàn)紅色的物質(zhì)基礎(chǔ),本研究以紅花草莓品種‘四季紅’為試材,選取了紅花草莓花瓣發(fā)育過程中具有明顯顏色變化的三個(gè)發(fā)育時(shí)期,即蕾期(PF_L)、轉(zhuǎn)色期(PF_Z)、大蕾期(PF_D)的花瓣樣品,構(gòu)建了9個(gè)小RNA文庫(kù)(PF_L1、PF_L2、PF_L3、PF_Z1、PF_Z2、PF_Z3、PF_D1、PF_D2、PF_D3)和1個(gè)混合樣品的降解組文庫(kù)(PF)。通過應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)挖掘參與紅花草莓花瓣發(fā)育過程中的miRNAs,重點(diǎn)發(fā)現(xiàn)能夠參與花青素苷生物合成調(diào)控的miRNAs。利用TargetFinder軟件及降解組測(cè)序技術(shù)對(duì)紅花草莓小RNA測(cè)序獲得的miRNA進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證。此外,通過應(yīng)用geNorm和NormFinder等程序?qū)RT-PCR定量的結(jié)果進(jìn)行分析,篩選出適合用于紅花草莓miRNA表達(dá)水平相對(duì)定量的表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因,為紅花草莓花色相關(guān)miRNAs的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:(1)9個(gè)小RNA文庫(kù)(PF_L1、PF_L2、PF_L3、PF_Z1、PF_Z2、PF_Z3、PF_D1、PF_D2、PF_D3)通過小RNA測(cè)序技術(shù)得到的原始Total reads數(shù)分別為1.70×10~7、1.59×10~7、1.47×10~7、1.27×10~7、1.27×10~7、1.46×10~7、1.18×10~7、1.26×10~7和1.32×10~7條。共鑒定到1,703個(gè)miRNAs,其中665個(gè)miRNAs在9個(gè)樣品小RNA文庫(kù)中均存在。在3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花瓣中共鑒定到317個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNAs,其中有127個(gè)miRNA的差異程度達(dá)到了極顯著水平。(2)通過降解組測(cè)序,在PF文庫(kù)得到2.37×10~7條原始reads。當(dāng)去除掉3'接頭序列后,發(fā)現(xiàn)PF降解組文庫(kù)中可以匹配到草莓基因組上的reads為2.34×10~7條,目前草莓已注釋的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為39,487個(gè),降解組文庫(kù)PF能夠匹配到草莓已注釋轉(zhuǎn)錄本數(shù)為34,202個(gè),占已注釋草莓總轉(zhuǎn)錄本的比例為86.26%。應(yīng)用TargetFinder軟件進(jìn)行miRNA的靶基因預(yù)測(cè),結(jié)果顯示1365個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的14,406個(gè)靶基因。利用Cleaveland軟件對(duì)降解組測(cè)序數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行降解位點(diǎn)的檢測(cè),共檢測(cè)到了166個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的227個(gè)靶基因發(fā)生降解。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在miRNA-靶基因?qū)χ?有超過80%的miRNA對(duì)應(yīng)多個(gè)靶基因,單個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)靶基因的數(shù)目從2到26個(gè)不等,只有12個(gè)miRNA分別只對(duì)應(yīng)1個(gè)的靶基因。此外,還發(fā)現(xiàn)普遍存在單個(gè)靶基因受控于多個(gè)miRNA調(diào)節(jié)的情況。這表明miRNA與靶基因之間存在著復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。(3)應(yīng)用geNorm、NormFinder和Bestkeeper軟件對(duì)8候選miRNA的內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。3款軟件評(píng)價(jià)結(jié)果表明,mdm-miR11004是紅花草莓花色相關(guān)的miRNA實(shí)時(shí)熒光定量的最適候選內(nèi)參基因,bdi-miR159a是在紅花草莓所有組織樣品中表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因。(4)通過對(duì)miRNA、轉(zhuǎn)錄組和降解組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析,初步篩選得到了33個(gè)和紅花草莓花色形成相關(guān)的候選miRNAs和其對(duì)應(yīng)的40個(gè)靶基因。并選擇了8個(gè)花色相關(guān)的候選miRNA在不同顏色紅花草莓花瓣中進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)特性分析。初步獲得了可能通過負(fù)調(diào)控的模式參與到花色的調(diào)控中2個(gè)miRNA及其對(duì)應(yīng)的靶基因,即mdm-miR159d與靶基因NCL1和csi-miR156f-p5與靶基因SPL13和MYB44。這2個(gè)miRNAs在紅花草莓花青素苷的生物合成中可能具有重要的作用。
【圖文】：

圖 1 花青素苷的生物合成途徑及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)（戴思蘭 等，2016）CHS：查爾酮合成酶；CHI：查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶；F3′5′H：類黃酮-3′5′-羥基化酶；F3′H：類黃酮-3′-羥基化酶；F3H：黃烷酮-3-羥基化酶；FLS：黃酮醇合成酶；DFR：二氫黃酮醇-4-還原酶；ANS：花青素苷合成酶；ANR：花青素苷還原酶；LAR：無(wú)色花青素苷還原酶；GT：糖基轉(zhuǎn)移酶；AT：�；D(zhuǎn)移酶；MT：甲基轉(zhuǎn)移酶Fig. 1 The biosynthetic pathway of anthocyanins and key nodesCHS: chalcone synthase；CHI: chalcone isomerase；F3′5′H: flavonoid-3′5′-hydroxylase；F3′H: flavonoid-3′-hydroxylase；F3H: flavanone 3-hydroxylase；FLS: flavonol synthase；DFR: dihydroflavonol 4-reductase；ANS: anthocyanin synthase；ANR: anthocyanidin reductase; LAR: leucoanthocyanidin reductase; GT: glycosyl transferases；AT: acyl transferase；MT:methyl transferase1.1.3 調(diào)控植物花青素苷合成的結(jié)構(gòu)基因隨著分子生物學(xué)以及高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，多種參與植物類黃酮代謝途徑的相關(guān)結(jié)構(gòu)基因逐漸被克隆。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) CHS、CHI、F3H、FLS、ANS 和 DFR 等多種主要參與花青素合成的結(jié)構(gòu)基因。Li et al.（2001）認(rèn)為 PAL 和 CHS 在草莓果實(shí)成熟過程中沒有很大的變化，，而 CHI 和 DFR 在果實(shí)著色時(shí)表達(dá)量大量增加。但是也有資料報(bào)

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文2 材料與方法2.1 試驗(yàn)材料試材來(lái)源于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)草莓資源圃，課題組自育的紅花草莓品種‘四季紅’，花紅色（N57 A），具四季開花習(xí)性（圖 2）。根據(jù)萼片和花瓣形態(tài)特征，將花瓣發(fā)育過程劃分為 5 個(gè)不同階段（表 1，圖 3），選取了紅花草莓花瓣發(fā)育過程中具有明顯顏色變化的三個(gè)發(fā)育時(shí)期，即蕾期（PF_L）、轉(zhuǎn)色期（PF_Z）、大蕾期（PF_D）的花瓣樣品用于RNA的提取以及后續(xù)的miRNA和降解組的測(cè)序，每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)每個(gè)重復(fù)取樣從苗齡且長(zhǎng)勢(shì)一致的 50 株紅花草莓品種‘四季紅’植株進(jìn)行。取樣時(shí)間為 2017 年 12 月至 2018 年 3 月，不同組織部位的樣品和不同花色樣品分別取自‘四季紅’的葉片，莖、果實(shí)及果柄和粉公主 ×俏佳人的雜交后代盛花期花瓣，用于內(nèi)參篩選及高通量測(cè)序驗(yàn)證，取樣后用液氮迅速冷凍，置于-80 ℃貯藏備用。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S668.4

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本文編號(hào)：2711617