【摘要】：魔芋系天南星科(Araceae),魔芋屬(Amorphophallus)植物的總稱,它是一種多年生草本植物。在中國,魔芋資源豐富,具有悠久的栽培歷史,在21個魔芋種中有11個種可以食用,其中6個種已有栽培。因其塊莖中含有大量的葡苷聚糖(glucomanna)和生物堿等物質而在食品、醫(yī)藥、化工中具有廣泛應用,具有較高開發(fā)利用價值。有關魔芋組織培養(yǎng)的研究在上個世紀80年代就早有報道,但因魔芋為單葉柄支撐的單復葉植物通常用地下根狀莖無性繁殖,其繁殖系數非常低再加上種芋根莖細嫩不能長距離運輸,使得魔芋繁殖一直阻礙著其的大面積發(fā)展,優(yōu)良品種推廣速度慢。目前,關于魔芋的生物學特性研究以及其塊莖中富含的葡甘聚糖的提取加工研究較多,但對魔芋塊莖中他有效成分(如神經酰胺)及其代謝途徑研究甚少。本研究不僅對魔芋組織培養(yǎng)中不同類型的愈傷組織進行了研究,還利用高通量測序(RNA-seq)技術對魔芋進行轉錄組測序,并將其數據進行分析,獲得蛋白質功能注釋、GO功能分析、KEGG代謝途徑等數據。在此基礎上篩選到了神經酰胺代謝途徑上的關鍵基因-中性神經酰胺酶基因(NCase),對其進行了克隆以及初步功能驗證。研究結果如下:利用白魔芋(A.albus)的雌蕊花序以及雄蕊為外植體,得到了5種不同類型的愈傷組織,對比了胚性愈傷非胚性愈傷組織之間的差別,并對魔芋胚性愈傷組織的發(fā)育過程進行了組織切片觀察,從中找到了胚性愈傷組織具有發(fā)育各個時期典型特點的組織結構。此外本研究還探討了最佳的外植體愈傷組織誘導培養(yǎng)基,分化培養(yǎng)基的激素種類及配比以及其pH值;培養(yǎng)的光照、溫度等。優(yōu)化組合得到白魔芋愈傷組織最佳誘導培養(yǎng)基:MS+1 mg/L NAA+2 mg/L 2,4-D+3 mg/L 6-BA,30g/L蔗糖,2g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP),白愈傷組織最適合的分化培養(yǎng)基為:MS+1 mg/L NAA+1 mg/L GA3+2 mg/L 6-BA,30g/L 蔗糖,2g/L PVP。白魔芋愈傷組織的誘導率最高可達到98.9%,分化率達到83.7%。農桿菌介導的白魔芋轉基因。在前面建立的胚性愈傷組織的快繁體系的基礎上,通過預培養(yǎng)、共培養(yǎng)篩選得到陽性愈傷組織,以Plasmid pCAMBIA1300為表達載體,將抗蟲基因Cry2A基因轉入到魔芋胚性愈傷組織中。提取再生植株葉片基因組并對其進行PCR檢測,初步證明外源基因已轉入到再生植株中,在實驗得到的6株再生植株中有兩株再生植株基因組中能檢測到Cry2A外源基因的成功轉入。利用Illumina HiSeq 2500高通量測序對彌勒魔芋(Amorphophallus muelleri)轉錄組進行了分析,獲得彌勒魔芋15,867,314原始讀序,數據量4.76G。除去含有帶接頭的、低質量的原始讀序,對原始數據過濾,得到15132167個讀序,數據量為4.54G。通過高級分析,給出所有all-unigene在樣品中的表達量信息和功能注釋信息,功能注釋信息包括KOG功能注釋和GO功能注釋、Pathway注釋,揭示了彌勒魔芋葉片中基因的表達狀況。從轉錄組數據中我們分析得到彌勒魔芋經酰胺的代謝途徑及代謝途徑中相關的13個酶。我們選擇了起到中樞調節(jié)作用的中性神經酰胺酶(neutral ceramidase)作為研究對象。首先我們通過RACE的方法,克隆得到了彌勒魔芋中性神經酰胺酶(NCase)的基因序列,為了進一步驗證NCase的功能,我們將其轉入到人工進行基因敲除的酵母,人工敲除釀酒酵母中神經酰胺酶基因YPC1p和YDC1p,排除酵母本身的干擾后,將得到的魔芋中性神經酰胺酶基因轉入雙缺型酵母中,通過Western blot檢測到不同時期神經酰胺酶表達量的不同。以C12-NBD神經酰胺將作為底物,在體外一定條件下反應,通過高效液相色譜儀(HPLC)的檢測,我們發(fā)現魔芋NCase能夠分解Cl 2-NBD神經酰胺。本研究首次探索了彌勒魔芋神經酰胺酶與各種干擾素通路中相關基因的相互作用,發(fā)現魔芋中性神經酰胺酶能促進IFNα IFNβ,ISRE以及IL29的表達,NCase能夠直接引起相關干擾素的基因的上調,而干擾素刺激會引起下游干擾素誘導基因(IFN stimulated genes,ISGs)表達變化,從而起到抗病毒的作用,研究還發(fā)現魔芋中性神經酰胺酶能對EV71病毒產生抑制作用,揭示了彌勒魔芋其在抗病毒方面的巨大潛力。
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組織的再生體系研究還很少，而且誘導以及分化效率不高。本研究用白魔兩種外植體為材料成功高效的誘導出胚性愈傷組織，并在此基礎之上建立于白魔芋胚性愈傷組織的轉基因再生體系，成功將基因轉入到了白中。逡逑２．１材料與方法逡逑２．１．１實驗材料逡逑材料來自于湖北恩施的白魔宇，，魔芋球蓮頂有花芽。保存于溫度在２８－３２度室內備用。逡逑大腸桿

本文編號：2685904