【摘要】：金柑(Kumquat)原產(chǎn)于我國,是蕓香科(Rutaceae)金柑屬(Fortunella)植物,為常綠灌木或小喬木。類黃酮是金柑果實中最重要的次生代謝產(chǎn)物之一,某些類黃酮成分具有清除人體內(nèi)產(chǎn)生的自由基,預防心腦血管疾病、抗衰老及抗癌等營養(yǎng)保健功效。類黃酮在植物中主要以糖基化的形式存在,糖基化修飾提升了類黃酮的穩(wěn)定性和水溶性,增加了其在植物體內(nèi)的積累。糖基化修飾主要由UDP-糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferase,UGT)催化完成的。植物中UGT基因通常以基因家族的形式存在,且數(shù)量眾多。如何從這些家族成員中準確篩選出參與類黃酮糖基化修飾的UGT,是功能研究中最為關鍵的一步。本研究以瀏陽金柑(Fortunella crassifolia Swingle)果實為實驗材料,首先利用靶向代謝組學技術對金柑果實各發(fā)育時期類黃酮進行了種類鑒定與相對定量分析,再通過轉錄組測序技術篩選了高表達的UGT基因,并結合相應生物信息學方法及代謝組實驗確定了與金柑類黃酮合成相關的UGT候選基因,并完成了部分基因的克隆與測序工作。研究結果為進一步的功能鑒定等研究奠定了一定的基礎。本實驗取得的主要結果如下:1.利用液相色譜-高分辨質譜聯(lián)用儀(UPLC G2-S QTOF)對瀏陽金柑果實類黃酮種類進行了檢測,鑒定出了11種類黃酮,包括2種C-葡糖苷類黃酮、5種C-新橙皮糖苷類黃酮及4種O-新橙皮糖苷類黃酮,分別為維采寧-2(Apigenin-6,8-di-C-glucoside)、3',5'-雙碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素(3',5'-di-C-β-glucopyranosylphloretin)、木犀草素-8-C-新橙皮糖苷(Luteolin-8-CNeohesperidoside)、木犀草素-6-C-新橙皮糖苷(Luteolin-6-C-neohesperidoside)、芹菜素-8-C-新橙皮糖苷(Apigenin-8-C-neohesperidoside)、刺槐黃素-8-C-新橙皮糖苷(Acacetin-8-C-neohesperidosid)、刺槐黃素-6-C-新橙皮糖苷(Acacetin-6-C-neohesperidoside)、野漆樹苷(Apigenin7-O-neohesperidoside)、柚皮苷(Naringenin-7-O-neohesperidoside)、金柑苷(Acacetin7-O-neohesperidoside)、枸橘苷(Isosakuranetin7-O-neohesperidoside)。2.通過液相色譜峰面積,對瀏陽金柑果實中含量較高的5種類黃酮(3',5'-雙碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、芹菜素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黃素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黃素-6-C-新橙皮糖苷、金柑苷)做了相對定量分析,探討了其含量在瀏陽金柑果實各發(fā)育階段的變化規(guī)律。結果發(fā)現(xiàn),芹菜素-8-C-新橙皮糖苷的含量在果皮中呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢,在果肉中整體呈下降趨勢;其他類黃酮的變化趨勢基本一致,整體呈下降趨勢,且前期下降較快;3',5'-雙碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素在瀏陽金柑果實整個發(fā)育過程中的含量最高;另外,結果顯示瀏陽金柑果皮中類黃酮的含量普遍高于果肉。3.通過高通量測序技術對6個不同發(fā)育時期10個瀏陽金柑果實樣品進行轉錄組測序,以克萊門氏小柑橘(Citrus clementine)的基因組為參考對轉錄組數(shù)據(jù)進行分析,最終獲得高表達基因11350個。利用克萊門氏小柑橘蛋白數(shù)據(jù)庫對上述基因進行注釋及基序(Motif)檢測,最終界定49個高表達的FcUGT基因。4.基于轉錄組FPKM值分析基因表達模式,結果發(fā)現(xiàn)不同基因表達模式差異顯著。在果皮中,以花后99天為分界點,將這49個FcUGT基因分為兩種表達模式。第一種模式包含了24個FcUGT基因,我們發(fā)現(xiàn)這些基因在“花后99天”,這個分界點之前有更高的表達量;第二種模式包含了25個FcUGT基因,這些基因在“花后99天”,這個分界點之后有更高的表達量。相較于果皮,49個基因中的大部分基因在果肉中呈現(xiàn)一個低表達模式。5.以49個FcUGT基因和39個功能已知UGT基因的編碼蛋白序列構建進化樹,并結合瀏陽金柑果實中類黃酮糖元的種類及結構,對FcUGT基因功能進行預測。發(fā)現(xiàn)其中25個高表達的UGT可能參與了類黃酮糖基化修飾,并完成了8個糖基轉移酶候選基因的克隆與測序工作。
【圖文】：

稱取上述過 40 目篩子后的粉末樣品 0.5g 于 10mL 離心管，加入 7mL 純甲醇，混勻，超聲破碎 30min（功率 60%，水溫 45℃），5000rpm 離心 15min，取上清液于 25mL 棕色容量瓶，殘渣繼續(xù)加入 7mL 純甲醇，重復提取 3 次，用甲醇定容至25mL，取適宜提取液，加入適量去離子水稀釋，過 0.2μm 膜，放 4℃冰箱備用。3.2.2 超高效液相色譜（UPLC）條件對于 UPLC 條件的確定，在楊瑩等（2016）研究的基礎上，作了適當?shù)恼{整，提高了金柑果實中類黃酮物質的分離效果，在 8min 之內(nèi)基本上能將提取出來的類黃酮全部分離開。如圖 3-1 所示，為瀏陽金柑果實一個時期類黃酮的液相色譜圖。具體色譜條件如下所示:UPLC 檢測使用 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1×100 mm, 1.7μm，Waters，美國）；流動相 A 為 0.01%甲酸，B 為乙腈；流速為 0.3 mL.min-1；柱溫：40℃；進樣量為 1μL（每個樣品重復檢測 3 次）；檢測波長為 283nm、330nm、365nm；檢測范圍為 200nm-400nm。濃度梯度如下：0 min: 90% A+ 10% B; 2 min: 80% A+20% B; 5 min:75% A + 25% B; 9 min:65% A + 35% B。

西南大學碩士學位論文20圖3-3 金柑果實中類黃酮的結構。Nh代表新橙皮糖苷Fig.3-3 Structures for flavonoids found in fruits. Nh represents Neohesperidose3.3.3 瀏陽金柑果實各發(fā)育時期類黃酮的相對定量分析因瀏陽金柑果實中含量較多的幾種類黃酮國內(nèi)無商業(yè)化的標準品，為探討瀏陽金柑果實中各類黃酮含量的變化規(guī)律，本次實驗通過最大吸收波長下液相色譜峰面積對含量較高的 5 種類黃酮（3',5'-雙碳-β-D-吡喃葡萄糖基根皮素、芹菜素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黃素-8-C-新橙皮糖苷、刺槐黃素-6-C-新橙皮糖苷、金柑苷）在瀏陽金柑各個發(fā)育時期的相對定量做了比較，，探討了這 5 種類黃酮含量在瀏陽金柑果實各個發(fā)育時期的變化規(guī)律。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S666.1;Q78

【參考文獻】

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本文編號：2680211