【摘要】：植物絡(luò)合素(PCs)在生命有機(jī)體金屬離子平衡、解毒和轉(zhuǎn)運(yùn)累積體系中扮演著重要角色并有著廣泛的應(yīng)用前景,對(duì)其編碼基因的挖掘及功能探究已成為生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。孔雀草(Tagetes patula L.)為萬(wàn)壽菊屬一年生草本植物,在觀賞、園林綠化以及藥用等方面被廣泛應(yīng)用。本研究對(duì)孔雀草PCS基因cDNA全長(zhǎng)克隆,揭示鎘脅迫下PCS基因的表達(dá)模式和功能,為探明孔雀草鎘脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制提供理論依據(jù)。已取得研究結(jié)果如下:1.孔雀草PCS基因的克隆:通過同源引物擴(kuò)增方法獲得一保守區(qū)序列,該序列長(zhǎng)為311bp,BLAST發(fā)現(xiàn)該段保守序列跟苣買菜(Sonchus arvensis)(SaPCS1)和萵苣(Lactuca sativa)(LsPCS1)的相似性很高,達(dá)90%。以該保守序列設(shè)計(jì)引物,利用cDNA末端快速克隆(RACE)的技術(shù),對(duì)孔雀草PCS基因保守區(qū)序列分別進(jìn)行3′RACE和5′RACE擴(kuò)增,由此獲得3′端序列1401bpb和5′端序列568bp,利用MEGA6.0軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接,最終獲得雀草PCS基因全長(zhǎng)cDNA序列,基因全長(zhǎng)1970bp。對(duì)序列進(jìn)行開放閱讀框(ORF)分析表明:基因編碼區(qū)長(zhǎng)1764bp,編碼587個(gè)氨基酸。將該序列上傳至NCBI中并命名為孔雀草PCS1(TpPCS1)基因,登錄號(hào)為KY007159。2.孔雀草PCS基因的生物信息學(xué)分析:用DNAman軟件對(duì)TpPCS1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示:TpPCS1基因全長(zhǎng)1970bp,開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1764bp,編碼587個(gè)氨基酸,N端含9個(gè)半胱氨酸(Cys),具有34個(gè)酶切位點(diǎn);基因編碼蛋白分子量為65.23KDa,等電點(diǎn)為8.01,不穩(wěn)定系數(shù)為47.72,平均疏水性指數(shù)為-0.171,該蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白;基因編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)顯示該蛋白不存在信號(hào)肽,不屬于分泌蛋白,且跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白不存在跨膜區(qū),二者與功能域預(yù)測(cè)結(jié)果相符合,屬于植物絡(luò)合素合酶蛋白,功能為細(xì)胞內(nèi)重金屬鎘螯合劑;基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示蛋白屬于mixed型,以螺旋和轉(zhuǎn)角為主,與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果比較,二者結(jié)果吻合;從系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以看出,TpPCS1基因在進(jìn)化上與同屬植物苣買菜和萵苣關(guān)系較近。3.TpPCS1基因的表達(dá)分析:對(duì)不同Cd濃度脅迫TpPCS1基因相對(duì)表達(dá)量研究,以孔雀草18srRNA和萵苣β-actin mRNA做內(nèi)參,結(jié)果顯示:(1)相同鎘濃度脅迫下,根中TpPCS1基因表現(xiàn)出較高的表達(dá)量,葉和種子中TpPCS1基因表達(dá)量相對(duì)較低,產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與不同器官對(duì)鎘的富集量有關(guān),通常情況下,根中的鎘含量較其他器官都高;(2)相同生長(zhǎng)期,隨著鎘脅迫濃度的上升,植株根、莖、葉中TpPCS1基因的表達(dá)量均呈上升趨勢(shì),而在種子中,TpPCS1基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì);(3)同一器官,隨著鎘脅迫時(shí)間增長(zhǎng),根、莖中TpPCS1基因的表達(dá)量均表現(xiàn)上升趨勢(shì),其中根中表現(xiàn)明顯,而在葉中TpPCS1基因的表達(dá)量在低濃度時(shí)表現(xiàn)出高表達(dá),而高濃度時(shí)表達(dá)量有所減少。4.不同濃度鎘脅迫對(duì)孔雀草DNA甲基化的影響:利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)技術(shù),對(duì)不同濃度Cd脅迫下孔雀草基因組DNA甲基化變化情況進(jìn)行分析研究,結(jié)果表明:經(jīng)0、50、250和500 mg·kg-1濃度Cd處理后,基因組MSAP比率分別為24%、30%、35%和41%,全甲基化率分別為20%、23%、25%和27%,這表明重金屬脅迫處理后,DNA總甲基化水平隨Cd濃度升高而呈上升變化趨勢(shì);在DNA甲基化模式變化方面,50、250和500 mg·kg-1濃度脅迫下重新甲基化率分別為10%、10%和11%,重新甲基化為主要的甲基化變化模式。
【圖文】：

圖 1.1 PCs 分子結(jié)構(gòu)式（Clemens 等，2006）Fig.1.1 Molecular structural formula of PCs御重金屬毒性的一種重要物質(zhì)，，PCs 的積累是由金屬離子下所形成的。當(dāng)重金屬對(duì)植物處于毒親和力。PCs 作為重金屬平衡和解毒的一種途

圖 1.2 PCS 催化 PCs 的合成Fig.1.2 Synthesis of phytochelatins(PCs)by PCSCS 基因表達(dá)研究為了弄清 PCS 基因在重金屬脅迫環(huán)境下的表達(dá)情況及分子機(jī)理，實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)耐受重金屬脅迫和植物修復(fù)的可能性，這些基因的挖掘和合成表達(dá)在應(yīng)對(duì)植
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2;S681.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2655734