【摘要】：藍(lán)果忍冬(Lonicera caerulea L.)具有極高的花色苷含量,是提取可食用天然色素的良好資源,更是極具發(fā)展?jié)摿Φ慕?jīng)濟(jì)保健型果實(shí)。藍(lán)果忍冬果實(shí)著色是花色苷積累的過程,bHLH蛋白是調(diào)控著花色苷生物合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。然而,關(guān)于藍(lán)果忍冬花色苷合成的分子調(diào)控機(jī)理未見有研究報(bào)道。研究藍(lán)果忍冬花色苷合成的調(diào)控機(jī)制,既能為培育保健型植物品種提供理論基礎(chǔ),同時(shí)也可為植物抗逆分子機(jī)理的研究提供參考。本研究以藍(lán)果忍冬品種“蓓蕾”為材料,通過轉(zhuǎn)錄組測序、生物信息學(xué)分析、構(gòu)建LcTT8-EGFP綠色熒光載體和pBI121-LcTT8過表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因、亞細(xì)胞定位、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA酶聯(lián)免疫吸附、pH示差法、高效液相色譜法(HPLC)等方法,篩選出了參與藍(lán)果忍冬果實(shí)花色苷生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子LcTT8,并進(jìn)行了基因功能驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:(1)藍(lán)果忍冬bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定分析通過NCBI CDD、MEME方法結(jié)合藍(lán)果忍冬bHLH家族進(jìn)化樹分析了藍(lán)果忍冬bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守基序進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明:有43個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子都包含bHLH家族保守結(jié)構(gòu)域HLH(PF00010)或bHLH-MYC_N(PF14215)。幾乎所有43個(gè)藍(lán)果忍冬bHLH蛋白都含有Motif 1或Motif 2,Motif 1和Motif 2共同構(gòu)成了藍(lán)果忍冬bHLH轉(zhuǎn)錄因子的basic helix-loop-helix保守結(jié)構(gòu)域。并且,研究結(jié)果表明,含有類似保守基序的bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間具有更近的進(jìn)化關(guān)系。(2)藍(lán)果忍冬花色苷生物合成相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的篩選通過blastx將43條藍(lán)果忍冬bHLH家族序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG(evalue0.00001),得到這些序列的蛋白功能注釋信息,結(jié)果表明:CL484.Contig3_All、Unigene21245_All、Unigene38564_All和Unigene7373_All與花色苷生物合成相關(guān)。將43條藍(lán)果忍冬bHLHs和225條擬南芥bHLHs合并構(gòu)建進(jìn)化樹預(yù)測藍(lán)果忍冬轉(zhuǎn)錄因子的功能,結(jié)果表明:藍(lán)果忍冬bHLHs可分成14個(gè)亞族,CL484.Contig3_All和Unigene21245_All聚類在主要調(diào)控花色苷合成的Ⅲ f亞族。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析了43個(gè)藍(lán)果忍冬bHLHs基因在不同組織部位、不同果實(shí)發(fā)育期的表達(dá)模式,結(jié)果表明:果實(shí)中的CL484.Contig3_All表達(dá)量顯著高于根、莖、葉、花;且當(dāng)果實(shí)發(fā)育到轉(zhuǎn)色期時(shí)CL484.Contig3_All表達(dá)量劇烈增高。最終篩選出藍(lán)果忍冬果實(shí)中調(diào)節(jié)花色苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子CL484.Contig3_All。(3)藍(lán)果忍冬TT8基因的克隆和生物信息學(xué)分析通過對(duì)藍(lán)果忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)裝配得到CL484.Contig3_All的CDs區(qū),命名為LcTT8。將LcTT8基因與克隆載體連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌測序,得到LcTT8核苷酸序列長度為2049bp。LcTT8蛋白質(zhì)為酸性蛋白(等電點(diǎn)pI為5.09),含有682個(gè)氨基酸,分子量為75928.12。預(yù)測LcTT8定位在細(xì)胞核,可能包含2個(gè)蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域,無信號(hào)肽位點(diǎn)。同時(shí)對(duì)LcTT8進(jìn)行了蛋白三維結(jié)構(gòu)建模預(yù)測。將LcTT8與其他植物TT8進(jìn)行多重序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)它們具有相似的保守序列。進(jìn)化樹顯示藍(lán)果忍冬TT8和甜櫻桃(Prunus avium)TT8進(jìn)化關(guān)系最近。(4)藍(lán)果忍冬TT8的亞細(xì)胞定位和基因表達(dá)分析利用擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析,在轉(zhuǎn)入空載體的擬南芥原生質(zhì)體中核、膜、質(zhì)均可見明亮的綠色熒光,而在轉(zhuǎn)入LcTT8-EGFP融合表達(dá)載體綠色熒光只富集在細(xì)胞核中。通過qRT-PCR分析LcTT8在藍(lán)果忍冬不同組織和不同果實(shí)時(shí)期的表達(dá)模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LcTT8在根、莖、葉、花中表達(dá)量低,在果實(shí)中表達(dá)量極高,是其他部位的4-23倍;果實(shí)發(fā)育期間,LcTT8表達(dá)量先增后減,在果實(shí)轉(zhuǎn)色初期達(dá)到峰值。(5)藍(lán)果忍冬TT8基因的功能驗(yàn)證構(gòu)建pBI121-LcTT8重組載體,利用煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系對(duì)LcTT8基因進(jìn)行功能驗(yàn)證,結(jié)果表明,LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草的葉片、種皮顏色出現(xiàn)不同程度的加深。pH示差法測量花色苷含量發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因煙草葉片的花色苷含量上升。通過對(duì)LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草葉片的花色苷合成基因CHS、CHI、F3H、DFR、ANS進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果表明,相比野生煙草,LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草葉片的F3H、DFR、ANS基因表達(dá)量大幅上調(diào)。檢測LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草葉片花色苷合成相關(guān)酶活性,結(jié)果表明,LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草的DFR、ANS酶活性上調(diào)最為明顯。通過花色苷含量檢測和HPLC分析花色苷組分,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因煙草葉片花色苷含量比野生煙草高,且主要是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷高于野生煙草。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S663.9

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本文編號(hào)：2629710