大鯢(Andrias davidianus Blanchard)俗名“娃娃魚”,屬于兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科、大鯢屬,是我國現(xiàn)存最大的也是最珍稀的物種,并被列為國家II類重點(diǎn)保護(hù)野生動物。我國在上個世紀(jì)70年代對大鯢進(jìn)行馴養(yǎng)和繁殖試驗(yàn),隨著大鯢人工繁殖的成功,大鯢養(yǎng)殖在陜西、四川、湖南、重慶、甘肅等省市快速發(fā)展,并逐步成為優(yōu)勢特色產(chǎn)業(yè)。大鯢蛙病毒(Chinese Giant Salamander Ranavirus, CGSRV)是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種嚴(yán)重危害大鯢養(yǎng)殖的新型病原微生物,它感染大鯢主要表現(xiàn)為體表出現(xiàn)潰瘍及大量的出血斑點(diǎn),頭部與四肢出現(xiàn)腫脹,有時形成潰瘍灶,被人們稱為“潰瘍病或大腳病”,一旦發(fā)病,很難治愈,死亡率高,甚至高達(dá)100%,故被養(yǎng)殖戶們稱為“大鯢的癌癥”。本研究建立了大鯢蛙病毒的LAMP檢測方法,以期為CGSRV的早期、快速、特異性診斷及該病的預(yù)警提供技術(shù)保障。根據(jù)GenBank中登錄大鯢蛙病毒MCP基因序列(登錄號：HQ684746),利用LAMP引物設(shè)計網(wǎng)站(primerExplorerV4 (http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計4條特異...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
1. 文獻(xiàn)綜述
    1.1 大鯢病害研究概況
        1.1.1 大鯢養(yǎng)殖現(xiàn)狀
        1.1.2 大鯢常見疾病
    1.2 蛙病毒概述
        1.2.1 蛙病毒的生物學(xué)性狀
        1.2.2 蛙病毒感染的分布與危害
        1.2.3 蛙病毒感染的感染機(jī)制
        1.2.4 蛙病毒感染的病理學(xué)變化
        1.2.5 蛙病毒感染的診斷與防治
    1.3 環(huán)介導(dǎo)的核酸等溫擴(kuò)增(LAMP)檢測技術(shù)
        1.3.1 LAMP技術(shù)
        1.3.2 LAMP技術(shù)引物設(shè)計的基本原理
        1.3.3 LAMP技術(shù)的原理
        1.3.4 LAMP產(chǎn)物的檢測
        1.3.5 LAMP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)
        1.3.6 LAMP技術(shù)的缺點(diǎn)
        1.3.7 LAMP技術(shù)的運(yùn)用
    1.4 研究目的與意義
2. 材料
    2.1 病毒來源
    2.2 主要試劑與耗材
    2.3 主要試劑配制方法
3 試驗(yàn)方法
    3.1 大鯢蛙病毒LAMP技術(shù)引物設(shè)計
    3.2 大鯢蛙病毒的細(xì)胞培養(yǎng)
    3.3 大鯢蛙病毒總基因組DNA的提取
    3.4 大鯢蛙病毒普通PCR和巢氏PCR引物的設(shè)計
    3.5 大鯢蛙病毒巢氏PCR的擴(kuò)增
    3.6 構(gòu)建目標(biāo)序列質(zhì)粒
        3.6.1 PCR擴(kuò)增片段的膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和鑒定
        3.6.2 E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.6.3 重組質(zhì)粒的連接
        3.6.4 E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        3.6.5 重組質(zhì)粒陽性克隆的篩選
        3.6.6 重組質(zhì)粒的提取和鑒定
    3.7 CGSRV LAMP擴(kuò)增體系及條件優(yōu)化
        3.7.1 LAMP反應(yīng)體系中Tm值的優(yōu)化
        3.7.2 LAMP反應(yīng)體系中反應(yīng)時間的優(yōu)化
        3.7.3 LAMP反應(yīng)體系中Mg²⁺濃度的優(yōu)化
        3.7.4 LAMP反應(yīng)體系中dNTPs濃度的優(yōu)化
        3.7.5 LAMP反應(yīng)體系中引物濃度的優(yōu)化
        3.7.6 LAMP反應(yīng)體系中Bst DNA聚合酶濃度的優(yōu)化
    3.8 LAMP檢測方法特異性的檢測
    3.9 LAMP檢測方法靈敏度的檢測
    3.10 不同加熱方式對LAMP試驗(yàn)的影響
    3.11 LAMP在快速檢測大鯢蛙病毒中的運(yùn)用
4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 大鯢蛙病毒的細(xì)胞培養(yǎng)
    4.2 大鯢蛙病毒巢氏PCR的擴(kuò)增
    4.3 PCR鑒定與序列測定
    4.4 CGSRV LAMP擴(kuò)增體系及條件優(yōu)化
        4.4.1 LAMP反應(yīng)體系中Tm值的優(yōu)化
        4.4.2 LAMP反應(yīng)體系中反應(yīng)時間的優(yōu)化
        4.4.3 LAMP反應(yīng)體系中Mg²⁺濃度的優(yōu)化
        4.4.4 LAMP反應(yīng)體系中dNTPs濃度的優(yōu)化
        4.4.5 LAMP反應(yīng)體系中引物濃度的優(yōu)化
        4.4.6 LAMP反應(yīng)體系中Bst DNA聚合酶濃度的優(yōu)化
    4.5 LAMP檢測方法特異性的檢測
    4.6 LAMP檢測方法靈敏度的檢測
    4.7 不同加熱方式對LAMP試驗(yàn)的影響
    4.8 LAMP在快速檢測大鯢蛙病毒中的運(yùn)用
5 討論
    5.1 大鯢蛙病毒的危害與診斷
    5.2 LAMP檢測方法的優(yōu)勢與運(yùn)用
    5.3 LAMP檢測方法的假陽性問題
    5.4 LAMP檢測方法的影響因素
        5.4.1 LAMP引物
        5.4.2 LAMP反應(yīng)中Mg²⁺濃度和溫度的影響
6. 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3938468