發(fā)布時間：2024-03-12 01:10

　　由酚氧化酶原激活系統(tǒng)調控的黑化作用在無脊椎動物防御病原微生物入侵機體的過程中起到了重要作用。脂多糖和β-1,3-葡聚糖結合蛋白(LGBP)作為一種模式識別蛋白(PRP),已經在昆蟲和蝦中證實能夠激活酚氧化酶原系統(tǒng)。基于此,我們探究LGBP在中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)這一重要的經濟水產中是否同樣能夠激活酚氧化酶原系統(tǒng)引發(fā)黑化作用等免疫反應。通過定量PCR分析,發(fā)現(xiàn)LGBP基因在檢測的所有組織中都表達,并且在血細胞、鰓、腸和腦中表達量更高。當LPS和β-1,3-葡聚糖體內攻毒中華絨螯蟹12 h時,血細胞中LGBP的表達量明顯升高。通過原核表達技術和親和層析獲得了重組LGBP蛋白(rEsLGBP)。通過蛋白免疫印跡實驗,發(fā)現(xiàn)rEsLGBP能夠結合所有的檢測菌(包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌),同時發(fā)現(xiàn)該蛋白可以與LPS和β-1,3-葡聚糖這兩類病原相關分子模式(PAMP)結合而不與肽聚糖結合。將LGBP孵育的瓊脂糖鎳珠加入到血淋巴中,觀察到了明顯的血細胞脫顆�，F(xiàn)象以及對鎳珠的包裹作用。隨后,證實了1EsLGBP能夠誘導全血依賴的黑化作用并且驗證了不同血淋巴組分對...

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
內容摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    第一節(jié) 無脊椎動物先天免疫概述
        1.1 引言
        1.2 細胞免疫
        1.3 體液免疫
    第二節(jié) 無脊椎動物酚氧化酶級聯(lián)反應概述
        2.1 引言
        2.2 酚氧化酶級聯(lián)反應的組成
        2.3 酚氧化酶原級聯(lián)反應的激活
        2.4 酚氧化酶原級聯(lián)反應的調控
    第三節(jié) 本研究的意義及技術路線
第二章 LGBP基因表達模式分析
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 中華絨螯蟹體內PAMP免疫注射、樣品收集
        2.2 EsLGBP的組織表達檢測
        2.3 三種PAMP免疫刺激后EsLGBP的誘導表達檢測
    第三節(jié) 結果
        3.1 EsLGBP的組織表達分析
        3.2 三種PAMP免疫刺激后EsLGBP的誘導表達模式分析
    第四節(jié) 討論
第三章 rEsLGBP參與酚氧化酶原激活系統(tǒng)等免疫反應研究
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 重組rEsLGBP表達載體的構建
        2.2 EsLGBP重組蛋白的表達、純化并復性
        2.3 r EsLGBP與不同病原菌及PAMP結合實驗
        2.4 蛋白印跡檢測
        2.5 r EsLGBP的血細胞調理活性檢測(包裹作用)
        2.6 r EsLGBP誘導黑化作用的檢測
        2.7 E-GBP影響酚氧化酶酶活性的檢測
    第三節(jié) 結果
        3.1 重組r EsLGBP的分析
        3.2 重組r EsLGBP與微生物和病原模式分子結合活性分析
        3.3 重組r EsLGBP的血細胞調理活性分析
        3.4 重組r EsLGBP誘導黑化作用的分析
        3.5 重組r EsLGBP對酚氧化酶酶活性的影響
    第四節(jié) 討論
第四章 EsLGBP體外干擾后,酚氧化酶原激活系統(tǒng)相關基因表達量的檢測
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 中華絨螯蟹原代血細胞的培養(yǎng)
        2.2 EsLGBP的體外干擾
        2.3 EsLGBP干擾后對PO-AS相關基因的檢測
    第三節(jié) 結果
        3.1 干擾效果檢測
        3.2 干擾LGBP后,酚氧化酶原激活系統(tǒng)相關基因表達量的檢測
    第四節(jié) 討論
第五章 總結與展望
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3926306