單殖吸蟲(Monogenean)是一類常見的魚類寄生蟲,廣泛分布于世界各地淡、海水水域。常因大量寄生及其引起的繼發(fā)性疾病感染,造成幼魚大量死亡,給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經濟損失。指環(huán)蟲屬(Dactylogyrus)和三代蟲屬(Gyrodactylus)是單殖吸蟲綱中物種數目最豐富、也是危害最嚴重的屬。目前,漁業(yè)生產中,國標漁藥因長期、連年持續(xù)增加使用劑量引起寄生蟲的耐藥性發(fā)生,加大了單殖吸蟲病防治難度,因此,新藥的創(chuàng)制引起水產領域極大的關注。天然產物不僅生物活性豐富而且骨架結構多樣,是藥物研發(fā)的理想來源。前期,本實驗室運用活性跟蹤法從藥用植物中分離鑒定出多種殺滅指環(huán)蟲的活性小分子,其中牛蒡子苷元(Arctigenin,ARG)殺蟲效果顯著、對魚類毒性低,是理想的開發(fā)成為專用殺蟲漁藥的先導化合物。然而,缺乏對先導化合物作用靶點和機制的研究將限制先導化合物的進一步結構優(yōu)化,阻礙藥物的研發(fā)進程。本研究首先構建小林三代蟲(Gyrodactylus kobayashii)感染金魚實驗模型,在此基礎上,通過ARG作用小林三代蟲形態(tài)學、RNA-seq轉錄組學和iTRAQ定量蛋白組學以及利用金納米探針分...

【文章頁數】：181 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 三代蟲簡介
        1.1.1 三代蟲形態(tài)結構
        1.1.2 三代蟲分類學
        1.1.3 三代蟲感染宿主免疫反應
        1.1.4 三代蟲的危害以及防治策略
    1.2 牛蒡子苷元研究進展
        1.2.1 殺蟲作用
        1.2.2 抗炎作用
        1.2.3 調節(jié)心血管系統
        1.2.4 降血糖
        1.2.5 抗腫瘤作用
        1.2.6 其他生物活性
    1.3 小分子化合物靶點鑒定方法概述
        1.3.1 轉錄組學在藥物靶點鑒定中的應用
        1.3.2 蛋白組學在靶點鑒定中的應用
        1.3.3 直接靶點鑒定方法
    1.4 金納米顆粒概述
        1.4.1 金納米粒子的制備
        1.4.2 金納米粒子表面修飾
        1.4.3 金納米粒子在藥物靶點鑒定中的應用
    1.5 選題目的和意義
第二章 小林三代蟲感染金魚實驗模型的建立
    2.1 材料與方法
        2.1.1 動物和藥品
        2.1.2 試劑和儀器
        2.1.3 無蟲金魚的獲得
        2.1.4 小林三代蟲純化培養(yǎng)
        2.1.5 三代蟲的種類鑒定
        2.1.6 小林三代蟲保種
        2.1.7 酶切法快速鑒定金魚三代蟲種類
        2.1.8 金魚對小林三代蟲感染的免疫應答
    2.2 結果與分析
        2.2.1 寄生金魚三代蟲種類
        2.2.2 小林三代蟲形態(tài)學鑒定結果
        2.2.3 小林三代蟲分子生物學鑒定結果
        2.2.4 酶切法鑒定小林三代蟲-金魚模型純化結果
        2.2.5 金魚對小林三代蟲感染的免疫應答
    2.3 討論
        2.3.1 小林三代蟲是自然感染金魚優(yōu)勢種類
        2.3.2 小林三代蟲感染金魚實驗模型可穩(wěn)定傳代
        2.3.3 細胞因子的表達與清除三代蟲感染有關
    2.4 小結
第三章 牛蒡子苷元安全性評價及作用小林三代蟲形態(tài)學研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗動物
        3.1.2 試驗藥品
        3.1.3 試劑和儀器
        3.1.4 殺蟲活性評價
        3.1.5 金魚安全性評價
        3.1.6 ARG對三代蟲活動能力的影響
        3.1.7 ARG對三代蟲超微結構的影響
        3.1.8 ARG對三代蟲肌肉結構的影響
    3.2 結果與分析
        3.2.1 ARG殺蟲活性
        3.2.2 ARG對金魚的安全性評價結果
        3.2.3 ARG處理后三代蟲作用癥狀
        3.2.4 三代蟲表皮超微結構變化
        3.2.5 三代蟲內部超微結構變化
        3.2.6 肌肉結構損傷結果
    3.3 討論
        3.3.1 ARG顯示較低的毒性
        3.3.2 ARG顯示新穎的殺滅三代蟲機制
        3.3.3 ARG殺蟲機制與表皮破壞和呼吸抑制有關
    3.4 小結
第四章 牛蒡子苷元對小林三代蟲轉錄組水平的影響
    4.1 材料與方法
        4.1.1 供試動物
        4.1.2 試驗藥品
        4.1.3 試劑和儀器
        4.1.4 小林三代蟲的培養(yǎng)
        4.1.5 ARG藥浴三代蟲的收集
        4.1.6 總RNA提取及定量
        4.1.7 cDNA文庫的構建、質量檢測及測序
        4.1.8 測序數據組裝和注釋
        4.1.9 基因差異表達分析
        4.1.10 GO和 KEGG網絡富集分析
        4.1.11 qRT-PCR驗證
    4.2 結果與分析
        4.2.1 ARG藥浴的三代蟲活動能力和存活率統計結果
        4.2.2 總RNA質量檢測
        4.2.3 測序結果統計
        4.2.4 轉錄本拼接統計
        4.2.5 基因功能注釋
        4.2.6 基因差異表達分析
        4.2.7 差異表達基因GO富集分析
        4.2.8 差異表達基因KEGG富集分析
        4.2.9 差異表達基因韋恩圖分析
        4.2.10 qRT-PCR驗證結果
    4.3 討論
        4.3.1 三代蟲來源的RNA篩選方法可靠
        4.3.2 轉錄組測序獲得大量三代蟲基因信息
        4.3.3 ARG殺蟲作用于體壁結構破壞有關
        4.3.4 ARG藥浴引起三代蟲能量代謝紊亂
    4.4 小結
第五章 牛蒡子苷元作用小林三代蟲蛋白質組比較研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 供試動物
        5.1.2 試劑和儀器
        5.1.3 主要試劑配制
        5.1.4 ARG藥浴三代蟲的收集
        5.1.5 iTRAQ蛋白定量
        5.1.6 蛋白質定量和差異蛋白GO、KEGG通路富集分析
        5.1.7 轉錄組和蛋白質組關聯分析
        5.1.8 qRT-PCR分析
        5.1.9 ATP含量檢測
    5.2 結果與分析
        5.2.1 蛋白質量檢測結果
        5.2.2 蛋白質鑒定信息
        5.2.3 蛋白質COG功能注釋
        5.2.4 差異表達蛋白鑒定與分析
        5.2.5 蛋白質組與轉錄組關聯分析
        5.2.6 ARG對三代蟲ATP酶以及呼吸鏈復合物基因表達的影響
        5.2.7 ARG對小林三代蟲ATP含量的影響
    5.3 討論
        5.3.1 iTRAQ技術為研究ARG的殺蟲機制奠定基礎
        5.3.2 ARG作用下小林三代蟲差異蛋白分析
    5.4 小結
第六章 利用金納米探針鑒定牛蒡子苷元作用小林三代蟲靶點
    6.1 材料與方法
        6.1.1 供試動物
        6.1.2 試劑與儀器
        6.1.3 化合物2 的合成與殺蟲活性評價
        6.1.4 化合物6和10 的設計與合成
        6.1.5 金納米探針GNP-6和GNP-10 的合成
        6.1.6 金納米探針透射電鏡觀察
        6.1.7 傅立葉變換紅外光譜檢測
        6.1.8 HPLC-MS/MS定量配體
        6.1.9 金納米探針蟲體攝取的電鏡觀察
        6.1.10 金納米探針離體殺蟲活性評價
        6.1.11 小林三代蟲裂解液的準備
        6.1.12 靶點蛋白的鑒定
    6.2 結果與分析
        6.2.1 化合物1-10 的結構表征
        6.2.2 化合物2 在體作用小林三代蟲活性
        6.2.3 金納米探針形貌觀察和粒徑分布
        6.2.4 金納米探針傅里葉變換紅外光譜檢測
        6.2.5 金納米探針的表面配體定量
        6.2.6 金納米探針蟲體定位研究及殺蟲活性評價
        6.2.7 化合物1 的靶點鑒定
    6.3 討論
        6.3.1 MyosinⅡ是ARG作用小林三代蟲直接靶點
        6.3.2 肌球蛋白是一類重要的藥物驅蟲靶點
    6.4 小結
第七章 結論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介



本文編號：3835071