牙鲆是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類,其典型的胚后變態(tài)發(fā)育使之成為變態(tài)發(fā)育機(jī)制的良好模型,其中肌肉發(fā)育是牙鲆變態(tài)發(fā)育中一個(gè)極其重要和復(fù)雜的生物學(xué)過程。血清應(yīng)答因子(SRF)是MADS(MCM1,AGAMOUS,DEFICIENS和SRF)框基因家族的成員之一。在真核生物中高度保守,在各組織器官中廣泛表達(dá),是生物體內(nèi)重要的多功能轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞中以同源二聚體的形式與DNA序列CC(A/T)6GG(CAr G元件)結(jié)合后,通過MAPK或Rho A途徑調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá),它能夠激活肌相關(guān)因子(Myogenin、Myo D、SM22、MLC)調(diào)控肌細(xì)胞的生長、增殖及分化等,從而影響肌肉發(fā)育及收縮功能。Micro RNA(mi RNA)是一類由18²5個(gè)堿基組成的內(nèi)源性非編碼小單鏈RNA分子,通常在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶基因的m RNA翻譯或降解靶基因m RNA來發(fā)揮作用。mi R-133a在肌肉組織中特異存在參與調(diào)控肌肉發(fā)育,可促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖,而抑制成肌細(xì)胞的分化。本課題組已分析了pol-mi R-133a和MRFs(Myo D、Myf5、Myogenin)在牙鲆變態(tài)過程中的表...

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1.牙鲆概述
    2.SRF研究概況
    3.Micro RNA研究概述
    4.研究目的與意義
第一章 牙鲆SRF基因的克隆及表達(dá)
    1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚和樣品采集
        1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑
        1.1.3 常用試劑的配置
        1.1.4 實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 總RNA的提取與鑒定
        1.2.2 cDNA鏈的合成
        1.2.3 引物設(shè)計(jì)
        1.2.4 牙鲆SRF基因片段克隆
        1.2.5 RAC E (Rapid Amplification c DNA Ends)實(shí)驗(yàn)
        1.2.6 牙鲆SRF基因序列分析
        1.2.7 熒光定量PCR
        1.2.8 Western blot實(shí)驗(yàn)
    1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        1.3.1 牙鲆SRF cDNA克隆及分析
        1.3.2 SRF基因在牙鲆發(fā)育中的表達(dá)
    1.4 討論
第二章Pol-mir-133a靶基因預(yù)測及驗(yàn)證
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 生物信息學(xué)預(yù)測miR-133 靶基因
        2.2.2 候選靶基因 3’UTR引物的設(shè)計(jì)
        2.2.3 靶基因載體的構(gòu)建
        2.2.4 靶基因驗(yàn)證
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 靶基因載體的構(gòu)建
        2.3.2 靶基因驗(yàn)證
    2.4 討論
第三章 牙鲆SRF基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建以及鑒定
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 總RNA的提取及c DNA的合成
        3.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成
        3.2.3 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.4 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞
        3.2.5 RT-PCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后SRF mRNA的表達(dá)
        3.2.6 Western blot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的表達(dá)
        3.2.7 牙鲆MRFs基因啟動(dòng)子序列的分析
        3.2.8 RT-PCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后MRFs的表達(dá)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.2 重組質(zhì)粒在牙鲆胚胎細(xì)胞中的表達(dá)
        3.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)染牙鲆胚胎細(xì)胞SRF mRNA表達(dá)
        3.3.4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞SRF蛋白表達(dá)水平
        3.3.5 牙鲆MRFs基因啟動(dòng)子序列的分析
        3.3.6 RT-PCR檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后MRFs的表達(dá)
    3.4 討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文
致謝



本文編號：3831812