以溶藻弧菌HY9901為模板，參照GenBank上登錄的其他溶藻弧菌菌株二氫硫辛酰胺脫氫酶基因及D-酪氨酸-tRNA脫�；富蛐蛄性O(shè)計(jì)引物，克隆了溶藻弧菌HY9901菌株的dldh和dtd基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明dldh基因含有一個(gè)1428bp的開放閱讀框，編碼475個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子量為50.99kDa，理論等電點(diǎn)為5.51，Blast分析發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌DLDH與副溶血弧菌同源性高達(dá)99%，與哈維氏弧菌高達(dá)96%。而dtd基因全長435bp，編碼144個(gè)氨基酸序列，理論分子量為16.09，理論等電點(diǎn)為4.98，Blast分析發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌DTD與副溶血弧菌同源性高達(dá)95%，與哈維氏弧菌高達(dá)96%。 將擴(kuò)增到的dldh與dtd分別亞克隆到pET-32a(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建pET-DLDH，pET-DTD原核表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。蛋白表達(dá)條件優(yōu)化分析，DLDH在37℃，IPTG濃度0.7mmol/L時(shí)誘導(dǎo)4h蛋白表達(dá)量最大，重組蛋白主要以包涵體形式存在；DTD在37℃，0.1mmol/L的IPTG濃度下誘導(dǎo)5h時(shí)重組蛋白以包涵體形式大量表達(dá)。蛋...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 三種弧菌研究簡介
        1.1.1 溶藻弧菌
        1.1.2 哈維氏弧菌
        1.1.3 副溶血弧菌
    1.2 疫苗的研究進(jìn)展
        1.2.1 傳統(tǒng)疫苗
        1.2.2 基因工程疫苗
    1.3 DLDH 及 DTD 的研究進(jìn)展
        1.3.1 二氫硫辛酰胺脫氫酶
        1.3.2 D-酪氨酰-tRNA 脫�；�
    1.4 本研究技術(shù)路線
    1.5 研究目的及意義
2 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的克隆與原核表達(dá)
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 質(zhì)粒載體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
        2.1.6 生物信息學(xué)分析軟件
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的克隆
        2.2.2 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的原核表達(dá)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的克隆
        2.3.2 溶藻弧菌 dldh、dtd 基因的原核表達(dá)
    2.4 討論
3 DLDH-DTD 融合表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 dldh 及 dtd 基因的擴(kuò)增
        3.2.2 重疊延伸拼接技術(shù)擴(kuò)增融合基因
        3.2.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)純化
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 融合基因的擴(kuò)增及菌落 PCR 鑒定
        3.3.2 原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)純化
    3.4 討論
4 DLDH、DTD 及 DLDH-DTD 融合基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)斜帶石斑魚的免疫效果
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株及質(zhì)粒
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)魚體
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 亞單位疫苗制作
        4.2.2 安全性評(píng)價(jià)
        4.2.3 對(duì)斜帶石斑魚的免疫保護(hù)
        4.2.4 抗體效價(jià)檢測(cè)（間接 ELISA）
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 安全性評(píng)估
        4.3.2 免疫保護(hù)率
        4.3.3 血清效價(jià)分析
    4.4 討論
5 DLDH 突變株的構(gòu)建及功能研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 菌株與質(zhì)粒
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.1.3 主要試劑與溶液
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 插入法構(gòu)建突變株
        5.2.2 突變株的遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)
        5.2.3 突變株與野生株生長曲線的比較
        5.2.4 細(xì)菌泳動(dòng)檢測(cè)
        5.2.5 酶活測(cè)定
        5.2.6 生物膜檢測(cè)
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 構(gòu)建插入突變株及遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)
        5.3.2 插入突變株遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)
        5.3.3 生長曲線的測(cè)定
        5.3.4 細(xì)菌泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)
        5.3.5 酶活測(cè)定
        5.3.6 生物膜檢測(cè)
    5.4 結(jié)論
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介
導(dǎo)師簡介



本文編號(hào)：3810779