本研究以某漁場病魚組織內(nèi)分離得到的傳染性造血器官壞死病病毒（IHNV）BJLL株為材料，進行了該病毒的實驗室培養(yǎng)、鑒定及其某些生物學(xué)特性研究，在此基礎(chǔ)上，制備了鼠抗IHNV多克隆抗體，克隆表達(dá)了IHNV的核蛋白（N）和糖蛋白（G），并對兩種蛋白進行Western-Blot和IFA檢測，以表達(dá)出的IHNV N蛋白作為免疫原，免疫小鼠制備抗血清，并對其進行效價測定等應(yīng)用。結(jié)果如下： 1、IHNV病毒的增殖純化和多抗制備 利用對IHNV敏感的大鱗大麻哈魚胚胎細(xì)胞系（CHSE）增殖病毒；測定了培養(yǎng)液中的病毒滴度和病毒在CHSE細(xì)胞中的生長曲線；采用超速離心法對收獲的病毒進行了純化；利用純化的IHNV病毒免疫小鼠制備多克隆抗體，間接ELISA法檢測表明獲得的鼠抗IHNV血清效價為1:8000。 2、IHNV N蛋白的表達(dá)純化及抗原性分析 參照GenBank已發(fā)表的IHNV的WRAC株N基因序列，以分離得到的IHNV毒株（BJLL株）為實驗材料，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將N基因克隆到pGM-T載體上，對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和序列測定。結(jié)果表明，擴增N基因片段的長度為... 

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Summary
第一章 文獻綜述
    1 文獻綜述
        1.1 傳染性造血器官壞死病概況
            1.1.1 IHNV 的發(fā)現(xiàn)、分布及危害
            1.1.2 IHNV 的病原學(xué)特征
            1.1.3 IHNV 基因組特征
            1.1.4 IHNV 疾病表現(xiàn)
            1.1.5 魚彈狀病毒的先天免疫反應(yīng)
            1.1.6 魚彈狀病毒體液免疫反應(yīng)
        1.2 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研究進展
            1.2.1 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)簡介
            1.2.2 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)特點
            1.2.3 宿主昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)條件
            1.2.4 桿狀病毒表達(dá)影響因素
        1.3 目的意義和研究內(nèi)容
第二章 IHNV 的純化及抗血清制備
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 病毒、細(xì)胞和實驗動物
            1.1.2 試劑與培養(yǎng)液
            1.1.3 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 細(xì)胞和病毒的體外培養(yǎng)
            1.2.2 RT-PCR 及擴增產(chǎn)物檢測
            1.2.3 病毒滴度（TCID50）測定
            1.2.4 病毒生長曲線的測定
            1.2.5 病毒的超離和純化
            1.2.6 抗 IHNV 鼠血清的制備
            1.2.7 抗 IHNV 病毒血清效價的測定
    2 結(jié)果
        2.1 IHNV 的增殖及純化
        2.2 RT-PCR 檢測
        2.3 病毒生長曲線測定
        2.4 小鼠抗 IHNV 血清效價的測定
    3 討論
    4 小結(jié)
第三章 IHNV 核蛋白（N）表達(dá)、純化和抗體制備
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 載體與菌株
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 Sf9 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑
            1.1.4 培養(yǎng)基
            1.1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑
            1.1.6 免疫熒光檢測（IFA）試劑
            1.1.7 免疫印跡試驗（Western-blot）試劑
            1.1.8 蛋白純化試驗試劑
            1.1.9 主要器材
        1.2 實驗方法
            1.2.1 pMD-N 質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.2 桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.2.3 pFB-N-BAC 的構(gòu)建
            1.2.4 重組病毒的獲得
            1.2.5 蛋白的表達(dá)純化與檢測
    2 結(jié)果與分析
        2.1 引物擴增結(jié)果
        2.2 pFB-N-BAC 陽性克隆鑒定
        2.3 IFA 鑒定結(jié)果
        2.4 Western-blot 鑒定結(jié)果
        2.5 N 蛋白的純化
        2.6 蛋白質(zhì)濃度測定
        2.7 IHNV N 蛋白抗血清與全病毒反應(yīng)
    3 討論
        3.1 成功構(gòu)建 N 蛋白桿狀病毒表達(dá)載體
        3.2 重組蛋白的表達(dá)與鑒定
    4 小結(jié)
第四章 IHNV G 基因桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)載體的構(gòu)建及表達(dá)鑒定
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 載體與菌株
            1.1.2 主要試劑
            1.1.3 Sf9 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑
            1.1.4 培養(yǎng)基
            1.1.5 免疫熒光檢測（IFA）試劑
            1.1.6 免疫印跡試驗（Western-blot）試劑
        1.2 實驗方法
            1.2.1 IHNV G 基因克隆
            1.2.2 桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.2.3 pFB-G-BAC 的構(gòu)建
            1.2.4 重組病毒的獲得
            1.2.5 蛋白的表達(dá)與檢測
    2 結(jié)果與分析
        2.1 引物擴增結(jié)果
        2.2 pFB-G -BAC 陽性克隆鑒定
        2.3 重組蛋白的生物學(xué)鑒定
            2.3.1 IFA 鑒定結(jié)果
            2.3.2 Western-blot 鑒定結(jié)果
    3 討論
        3.1 Sf9 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        3.2 重組蛋白的表達(dá)與鑒定
    4 小結(jié)
全文結(jié)論
參考文獻
致謝
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本文編號：3677858