半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）作為一種市場價(jià)值較高的海水魚,是我國沿海地區(qū),特別是北方沿海地區(qū)養(yǎng)殖普及率較高的經(jīng)濟(jì)種。馴化近20年來,養(yǎng)殖規(guī)模呈穩(wěn)定擴(kuò)大的趨勢。同時(shí),半滑舌鰨是比目魚類中,性別二態(tài)性程度最高的物種之一,雌魚相對于雄魚具有絕對的生長優(yōu)勢。事實(shí)上,由于雄魚的市場價(jià)值極低,生產(chǎn)中,往往只會選擇性保留少部分雄魚作為種魚進(jìn)行繁殖,其余會盡早的淘汰。因而,培育全雌或者高雌的半滑舌鰨苗種,是廣大科技工作者和養(yǎng)殖技術(shù)人員的育種方向之一。在自然條件及養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中,我們知道普遍存在半滑舌鰨偽雄魚。后者作為一種生理性別和遺傳性別不統(tǒng)一的“中性”魚,可能是造成半滑舌鰨群體性別比例的原因。早前的研究發(fā)現(xiàn),偽雄魚作為父本產(chǎn)生的后代更趨向于成為偽雄魚。這打破了正常1:1的性別比例,使生理性別雄魚在后代中不斷積累,比例越來越高。實(shí)際生產(chǎn)中,這個(gè)比例甚至達(dá)到80%以上,這對半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)是一個(gè)很大的沖擊,造成養(yǎng)殖效益逐年下降。因此,通過人工挑選繁育親本而控制半滑舌鰨性別比例是近幾年被廣泛開展的養(yǎng)殖技術(shù)服務(wù)工作。偽雄魚的識別已經(jīng)擺脫了單純?nèi)庋塾^察的初級階段,通過開發(fā)的性別特異分... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

RAA等溫?cái)U(kuò)增原理圖

上海海洋大學(xué)博士學(xué)位論文23標(biāo)記開發(fā)。從理論上講，具有IDP的該基因座的Z等位基因具有插入，而W等位基因則沒有。因此，跨越該基因座的PCR引物有望從具有ZW染色體的雌性個(gè)體（即雜合子基因型）和具有ZZ染色體的雄性個(gè)體的單一產(chǎn)物（即純合子基因型）擴(kuò)增出兩種大小的產(chǎn)物。圖2-1.目標(biāo)等位基因區(qū)內(nèi)W和Z等位基因的成對排列。綠色框中的紅色條表示超過700bp的最大IDP。潛在的單核苷酸多態(tài)性被標(biāo)記為紅色細(xì)條。下劃線表示CS-SEX-3引物對設(shè)計(jì)的位置。Figure2-1.ThepairwisealignmentbetweenWandZalleleswithinthetargetallelicregion.TheredbarsinthegreenboxindicatesthelargestIDPover700bp.PotentialSNPwastaggedwiththethinredbar.TheunderlinedtextindicatestheannealingsiteforCS-SEX-3primerpair.3.2IDP標(biāo)記開發(fā)為了驗(yàn)證IDP（>700bp）的作為標(biāo)記物的識別效力，設(shè)計(jì)了一對引物，并對三只雌性和三只雄性樣品中跨越IDP的區(qū)域的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用酚-氯仿提取法從經(jīng)過鑒定已知性別的半滑舌鰨魚鰭組織中提取基因組DNA。具體步驟：1）用剪刀剪取半滑舌鰨鰭條組織約40μg，晾干后，放入1.5mL的離心管中。向離心管中加入300μL組織裂解液(10mmol/LTris-CI，pH8.0；100mmol/LEDTA，pH8.0；100mmol/LNaCl；0.5%SDS)，用剪刀剪碎鰭條組織；2）向離心管中加入300μL組織裂解液，30μL蛋白酶K（20mg/mL）、5

上海海洋大學(xué)博士學(xué)位論文25向引物CS-SEX-3F：GCAGCAACCACATCCTCAGT和反向引物CS-SEX-3R：CAGGAACATGCAGTAGGACA）來擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。PCR結(jié)果表明，從所有三個(gè)雌性樣品中擴(kuò)增出兩條約620bp和1.4kb的PCR條帶，而從所有三個(gè)雄性樣品中擴(kuò)增出一個(gè)1.4kb的PCR條帶（圖2-2）。圖2-2.用雌雄魚各三個(gè)個(gè)體驗(yàn)證InDel標(biāo)記。A）用魚的外型（左）和性腺來描述魚的生理性別特征。B）用CS-SEX-3引物對進(jìn)行基因組PCR擴(kuò)增。ZZ1-3為雄性樣本，ZW1-3為雌性樣本。Figure2-2.TheInDelmarkervalidationusingthreefemaleandmalefishindividuals.A)Thecharacterizationoffishsamplesexbybodylength(left)andgonads.B)GenomicPCRamplificationusingCS-SEX-3primerpair.ZZ1-3aremalesamplesandZW1-3arefemalesamples.從兩端測序了總共9條PCR譜帶（三個(gè)雄性樣品各自的單條帶和三個(gè)雌性樣品各自的雙條帶）。Sanger測序結(jié)果表明，所有九個(gè)序列均與參考序列相同。因此，PCR擴(kuò)增是針對靶標(biāo)的，PCR產(chǎn)物的等位基因序列之間的序列比對證實(shí)了鑒定的IDP為目的片段。3.3利用PARMS識別單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記序列比對并且識別兩種候選的性別特異性單核苷酸多態(tài)性（SNP），這些單核苷酸多態(tài)性可用于區(qū)分W-和Z-等位基因（圖2-3）。根據(jù)PARMS-SNP基因分型的原理（類似于Kompetitive等位基因特異性PCR（KASP）分析），為兩個(gè)個(gè)候選SNP設(shè)計(jì)了兩組引物。兩個(gè)候選SNP，SNP_chr_8935925_C_T和SNP_chr_8936186_C_G，使用qPCR分析的降落PCR程序成功驗(yàn)證（圖3）。對于所有六個(gè)魚類樣本，使用兩個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行的基因分型與使用上述IDP標(biāo)記進(jìn)行的基因分型以及根據(jù)解剖記錄的樣本的實(shí)際性別一致。

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