為探知 tyrp1b、chmp7和konk3三種功能基因在魚類中的準(zhǔn)確作用和對魚類功能性狀的影響,本文以斑馬魚為研究對象,采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)三種基因的定點(diǎn)突變。設(shè)計(jì)Cas9靶位點(diǎn),構(gòu)建100 ng/μL的Cas9/gRNA顯微注射至斑馬魚單細(xì)胞期胚胎,采用Nest-PCR,片段測序和T7EI酶切檢測各基因的突變效應(yīng),并進(jìn)一步檢測F1代突變頻率,探討。試驗(yàn)結(jié)果如下：1.通過PCR片段測序和T7EI酶切兩種方法來確定tyrp1b、chmp7和kank3三個(gè)基因的單一高效靶位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)tyrp1b基因的b1靶位點(diǎn),chmp7基因的t1靶位點(diǎn),kank3基因的c3靶位點(diǎn)的基因突變非常高效,均可應(yīng)用于后續(xù)繁育工作。2.將100 ng/μL的Cas9/gRNA顯微注射,合理控制Cas9/gRNA劑量很重要,過高劑量的Cas9/gRNA會導(dǎo)致魚群畸形或死亡。3.F0代測序、F1代測序和TA克隆結(jié)果表明,Cas9介導(dǎo)的基因突變可隨生殖細(xì)胞遺傳至下一代,表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因突變具有可遺傳性。4.統(tǒng)計(jì)各基因突變率,發(fā)現(xiàn)cas9介導(dǎo)的tyrp1b突變率達(dá)到38.5%-45.... 

【文章來源】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)結(jié)構(gòu)??

性切割通常發(fā)生在鞭位點(diǎn)互補(bǔ)堿基旁的ＰＡＭ序列上游，其特異性由ＰＡＭ區(qū)前２０?ｂｐ的??ＲＮＡ－ＤＮＡ區(qū)（ＮＣＣ結(jié)構(gòu)）相互作用決定。而Ｃａｓ９的蛋白成分在與ｏｒ民ＮＡ和比ａｃｒＲＮＡ組??成復(fù)合體口?１］時(shí)，活性核蛋白通過識別并切割對應(yīng)于ｃｒＲＮＡ序列的ＤＮＡ序列，避免外源??啜菌體或質(zhì)粒入侵宿主細(xì)胞。該系統(tǒng)工作過程如圖２所示。??在基因組編輯過程中，ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ的必需部分可Ｗ合并成單鏈向?qū)В遥危??（ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，ｇＲＮＡ），連接在基因組中ＰＡＭ序列的后面，與Ｃａｓ９高效作用引起靴位點(diǎn)??（２０?ｂ的產(chǎn)生ＤＮＡ雙鏈斷裂。其介導(dǎo)ＤＮＡ雙鏈斷裂的過程如下：首先，ｔｒａｃｒＲＮＡ和??ｐｒｅ－ＲＮＡ?ａ打ａｙ被轉(zhuǎn)錄；其次，ｔｒａｃｒ民ＮＡ雜交至Ｉｊ?ｐｒｅ－民ＮＡ?ａｒｒａｙ重復(fù)序歹ｉｊ上并與Ｃａｓ９結(jié)??合在一起形成二聚體，進(jìn)一步介導(dǎo)ｐｒｅ－ＲＮＡ到成熟ｃｒＲＮＡ；再次，成熟的ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ??二聚體通過ｃｒ民ＮＡ上的巧ａｃｅｒｓ與ＤＮＡ靴序列上的ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒｓ形成異源二聚體；最后，??在?ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒｓ?中，Ｃａｓ９?在靴?ＤＮＡ?的?ＰＡＭ?上游介導(dǎo)產(chǎn)生?Ｄｏｕｂｌｅ?Ｓｔａｒａｎｄ?Ｂｒｅａｋｓ?口２—２４］。??斷裂的ＤＮＡ在細(xì)胞內(nèi)通過兩種不同的修復(fù)系統(tǒng)而發(fā)生作用，即非同源末端連接??（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｅｎｄｉｎｇ?ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥ＊！）或同源重組（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，?ＨＲ），而??這兩種修復(fù)途徑均會引入突變。??Ｇｅｎｏｍ把?ｌｏｃｕｓ?——?麵＾?１ＨＨ???Ｉ?ｔ??

已首次使用ＣＲＩＳＰ民技術(shù)完成了?ＲＮＡ介導(dǎo)的人類基因組編輯。杜克大學(xué)Ｐｒａｔｔ工程學(xué)院??的Ｇｅｒｓｂａ濁研究組ＰＳＩ己開始嘗試使用ＣＲＩＳＰＲ技術(shù)進(jìn)行基因治療。作為新興的基因組??編輯技術(shù)，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系統(tǒng)的相關(guān)研究正呈爆發(fā)式增長，如圖３所示。??１２００????論?１０００??——??妄?國??發(fā)８孤?????Ｈ??美?圓??數(shù)?６００??－?－．．．．疏???黑柳?１?１??－?２?郵?Ｉ?１０３?■?■■—??２０１１?２０１２?２０１３?２０１４?２０１己??論文發(fā)表年化（年）??圖３?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系統(tǒng)相關(guān)研究的論文數(shù)目??Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?打ｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｒｄａ化ｄ?ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?Ｃ民ＩＳＰＲ／Ｃａｓ?ｓｙｓ化ｍ??基因組編輯技術(shù)在水產(chǎn)生物中的研究成果相當(dāng)顯著，而斑馬魚Ｃ〇ａ加０?ｗＷｏ）作為模??式物種，其基因編輯的研究歷史最為悠久。２００８年Ｄｏｙｏｎ等Ｐ７印ｊ用ＺＦＮ技術(shù)在斑馬魚??體細(xì)胞和性細(xì)胞中同步打靴Ｗ／基因，同年Ｍｅｎｇ等也采用ＺＦＮ技術(shù)對Ａ成基因定向??打靴。２０１１年Ｓａｎｄｅ等Ｐ９詩Ｉｊ用ＴＡＬＥＮ技術(shù)對斑馬魚巧相扣和Ａ巧２基因進(jìn)行靴向?qū)嶒?yàn)，??同年化ａｎｇ等口Ｇ］利用ＴＡＬＥＮ技術(shù)介導(dǎo)化佩基因打靴。２０１２年中，Ｍｏｏｒｅ等口｜］、Ｃａｄｅ??等［３２］、Ｄ化ｌｅｍ等［３３］逐巧Ｗ?ＴＡＬＥＮ技術(shù)檢測了特異位點(diǎn)的基因功能。２０１３年Ｎａｎｎａｎ??Ｃｈａｎｇ等［３４蝴用ｃａｓ９技術(shù)分別對艦巧＞、護(hù)輸４和基因進(jìn)行打靴

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號：3476795