血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）是一種具有運(yùn)載氧、阿片肽、免疫調(diào)節(jié)、抗菌和鎮(zhèn)痛等功能的蛋白。本課題研究表明Hb片段（hemocidins）是機(jī)體在先天性免疫中殺死外源微生物的重要因子。單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus，Uu）隸屬于螠蟲動(dòng)物門，是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的無脊椎動(dòng)物。其長(zhǎng)期生活在海邊潮間帶泥性底質(zhì)中，為濾食性動(dòng)物，直接暴露于各種病原菌及寄生蟲等，但其非特異性免疫系統(tǒng)成功地抵御外來入侵，其中Hb可能起重要作用，而目前對(duì)Uu Hb的研究沒有相關(guān)報(bào)道。本課題根據(jù)Uu同屬物種美洲刺螠（Urechis caupo，Uc）Hb F-I完整的cDNA序列（GI:945055），通過3’RACE和5’RACE克隆了Uu Hb F-I的全長(zhǎng)cDNA，共780bp。開放閱讀框含429bp，翻譯為含142個(gè)氨基酸殘基的成熟肽，命名為UuHb-F-I。預(yù)測(cè)分子量為15120.67Da，等電點(diǎn)為9.02，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中含大量α螺旋。為獲得UuHb-F-I，構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)BL21（DE3）/pET-22b-UuHb-F-I，經(jīng)IPTG和乳糖誘導(dǎo)表達(dá)成功，其中乳糖誘導(dǎo)在37℃、180r/m... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：108 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 單環(huán)刺螠的研究進(jìn)展
        1.1.1 單環(huán)刺螠的簡(jiǎn)介
        1.1.2 單環(huán)刺螠的生物學(xué)研究
    1.2 血紅蛋白抗菌的研究進(jìn)展
        1.2.1 血紅蛋白抗菌性的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 Hemocidins 在體外抗菌的研究進(jìn)展
        1.2.3 Hemocidins 在體內(nèi)抗菌的研究進(jìn)展
        1.2.4 Hemocidins 的抗菌機(jī)制
        1.2.5 展望與應(yīng)用
    1.3 美洲刺螠血紅蛋白 F‐I 的研究概況
        1.3.1 美洲刺螠血紅蛋白的特點(diǎn)
        1.3.2 美洲刺螠血紅蛋白 F-I 全長(zhǎng) cDNA 序列
        1.3.3 美洲刺螠血紅蛋白 F-I 成熟肽序列
    1.4 研究目的與意義
    1.5 研究方法
        1.5.1 3’RACE 介紹
        1.5.2 5’RACE 介紹
        1.5.3 原核表達(dá)系統(tǒng)
        1.5.4 重組蛋白親和層析
        1.5.5 論文結(jié)構(gòu)安排
第2章 單環(huán)刺螠血紅蛋白 F-I 全長(zhǎng) cDNA 序列的克隆
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 主要試劑的配制
    2.2 單環(huán)刺螠血紅蛋白 F‐I 部分 cDNA 序列的克隆
        2.2.1 引物設(shè)計(jì)
        2.2.2 單環(huán)刺螠總 RNA 的提取
        2.2.3 反轉(zhuǎn)錄 PCR
        2.2.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.5 純化 PCR 產(chǎn)物
        2.2.6 構(gòu)建 T 克隆載體
        2.2.7 T-A 克隆菌落 PCR 驗(yàn)證
        2.2.8 小提質(zhì)粒 pUM-TA
        2.2.9 雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序
    2.3 3’RACE
        2.3.1 引物設(shè)計(jì)
        2.3.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.3.3 套式 PCR 反應(yīng)
        2.3.4 構(gòu)建 T 克隆載體及驗(yàn)證測(cè)序
    2.4 5’RACE
        2.4.1 引物設(shè)計(jì)
        2.4.2 去磷酸化反應(yīng)
        2.4.3 “去帽子”反應(yīng)
        2.4.4 5’RACE Adaptor 的連接
        2.4.5 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
        2.4.6 Outer PCR 反應(yīng)
        2.4.7 Inner PCR 反應(yīng)
        2.4.8 PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序
    2.5 生物信息學(xué)分析
    2.6 結(jié)果和分析
        2.6.1 部分 cDNA 序列的克隆
        2.6.2 3’RACE
        2.6.3 5’RACE
        2.6.4 生物信息學(xué)分析
    2.7 小結(jié)
    2.8 討論
第3章 UuHb-F-I 成熟肽的原核表達(dá)、純化及復(fù)性
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.3 試劑配制
    3.2 成熟肽原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.1 引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 UuHb-F-I 成熟肽基因的擴(kuò)增
        3.2.3 DNA 雙酶切
        3.2.4 表達(dá)載體 pET-22b-UuHb-F-I 的構(gòu)建
        3.2.5 重組質(zhì)粒的鑒定及測(cè)序
    3.3 重組蛋白的表達(dá)及鑒定
        3.3.1 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.2 SDS-PAGE 電泳
        3.3.3 優(yōu)化 IPTG 誘導(dǎo)條件
        3.3.4 乳糖誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.5 優(yōu)化乳糖誘導(dǎo)表達(dá)條件
        3.3.6 Western Blot
    3.4 重組蛋白的純化及復(fù)性
        3.4.1 重組蛋白親和層析
        3.4.2 重組蛋白的復(fù)性
    3.5 結(jié)果和分析
        3.5.1 PCR 擴(kuò)增成熟肽序列
        3.5.2 雙酶切 DNA 樣品
        3.5.3 重組菌的菌落 PCR 驗(yàn)證
        3.5.4 雙酶切驗(yàn)證
        3.5.5 表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序
        3.5.6 IPTG 誘導(dǎo)重組表達(dá)菌
        3.5.7 乳糖誘導(dǎo)表達(dá)重組表達(dá)菌
        3.5.8 Western Blot
        3.5.9 重組蛋白親和層析
    3.6 小結(jié)
    3.7 討論
第4章 重組蛋白的抗菌活性試驗(yàn)
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        4.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 試劑配制
    4.2 蛋白濃度測(cè)定
    4.3 平板法測(cè)活菌數(shù)
    4.4 抗菌活性試驗(yàn)
    4.5 結(jié)果和分析
        4.5.4 蛋白濃度測(cè)定
        4.5.5 抗菌試驗(yàn)
    4.6 小結(jié)
    4.7 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號(hào)：3433590