滇池金線魚巴（Sinocyclocheilus grahami, S. grahami）是云南的名貴水產(chǎn)之一,具有良好的食用和藥用價值。20世紀(jì)中期,滇池金線鲃是滇池中非常重要的經(jīng)濟魚類,但由于生存環(huán)境的惡化和過度捕撈,該物種已被列為國家Ⅱ級保護(hù)動物,并被列入《中國瀕危動物紅皮書·魚類》。本研究中對滇池金線鰓肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,并對其中一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行表達(dá)和性質(zhì)研究。主要研究成果如下：1.本文利用Hiseq 2500測序平臺對滇池金線鲃肌肉組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,經(jīng)過DENOVO組裝、功能注釋、CDS預(yù)測以及分析,共預(yù)測了22916條蛋白質(zhì),其中包含大量尚未見報道的滇池金線鰓所特有的蛋白質(zhì)信息,包括重要的生物活性分子如抗菌肽、抗氧化肽、蛋白酶抑制劑,為我們研究其重要的生物活性肽性質(zhì)和功能提供了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組測序獲得了滇池金線鰓生長發(fā)育、免疫應(yīng)答等眾多生理活動以及進(jìn)化過程基因轉(zhuǎn)錄的信息。為深入研究滇池金線鰓的種質(zhì)資源、對抗病原侵害的免疫應(yīng)答、生長發(fā)育的調(diào)控等諸多課題提供了一個強大的資源保障。2.半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin）作為半胱氨酸蛋白酶可逆抑制劑的一個超家族,... 

【文章來源】：昆明理工大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 滇池金線鰓概況
    1.2 魚類中半胱氨酸蛋白酶抑制劑研究進(jìn)展
    1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展
        1.3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)概念
        1.3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法
        1.3.3 RNA測序的流程
            1.3.3.1 文庫構(gòu)建
            1.3.3.2 測序
            1.3.3.3 生物信息學(xué)分析
    1.4 RNA測序技術(shù)在魚類中的研究進(jìn)展
        1.4.1 應(yīng)用RNA測序技術(shù)在魚類中獲得的生物見解
        1.4.2 轉(zhuǎn)錄組映射和基因組注釋
        1.4.3 新的轉(zhuǎn)錄物的發(fā)現(xiàn)
        1.4.4 轉(zhuǎn)錄后修飾(RNA剪接)
        1.4.5 SNP的發(fā)現(xiàn)
        1.4.6 量化轉(zhuǎn)錄水平
            1.4.6.1 發(fā)育生物學(xué)
            1.4.6.2 免疫學(xué)
            1.4.6.3 生理過程
            1.4.6.4 進(jìn)化生物學(xué)
    1.5 論文選題意義及研究內(nèi)容
第二章 滇池金線鲃的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物
        2.1.2 主要實驗試劑及儀器
        2.1.3 其他
    2.2 實驗方法
        2.2.1 滇池金線鲃肌肉組織的總RNA提取
        2.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建與測序
            2.2.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計
            2.2.2.2 轉(zhuǎn)錄本組裝
            2.2.2.3 Unigene功能注釋
            2.2.2.4 ORF/CDS預(yù)測
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 滇池金線鲃肌肉組織總RNA質(zhì)量檢測
        2.3.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計結(jié)果
            2.3.2.1 組裝轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)統(tǒng)計
            2.3.2.2 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量分布
            2.3.2.3 Unigene功能注釋
            2.3.2.4 ORF/CDS預(yù)測
    2.4 討論
第三章 滇池金線鲃中Cystatin-J cDNA序列獲得及分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗動物
        3.1.2 主要實驗試劑
        3.1.3 主要實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈
            3.2.1.1 滇池金線鲃肌肉組織總RNA的提取
            3.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄合成
        3.2.2 滇池金線鲃Cystatin-J序列的獲得
            3.2.2.1 PCR擴增Cystatin-J序列
            3.2.2.2 PCR擴增產(chǎn)物的檢測及目的片段純化
            3.2.2.3 連接反應(yīng)
            3.2.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.2.5 陽性克隆的篩選及測序
        3.2.3 滇池金線鰓cyatatin-J序列分析
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 Cystatin-J序列的獲得
            3.3.1.1 總RNA提取
            3.3.1.2 PCR擴增結(jié)果
        3.3.2 Cystatin-J序列分析
            3.3.2.1 Cystatin-J開放閱讀框的獲得
            3.3.2.2 理化性質(zhì)
            3.3.2.3 信號肽預(yù)測與糖基化位點預(yù)測
            3.3.2.4 二級結(jié)構(gòu)分析
            3.3.2.5 Cystatin-J三維結(jié)構(gòu)預(yù)測
            3.3.2.6 多重序列比對
            3.3.2.7 Cystatin-J蛋白同源物的進(jìn)化分析
    3.4 討論
第四章 滇池金線鲃Cystatin-J的原核表達(dá)、純化及活性檢測
    4.1 實驗材料
        4.1.1 主要實驗試劑及菌株
        4.1.2 主要實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 原核表達(dá)
            4.2.1.1 Cystatin-J基因克隆
            4.2.1.2 Cystatin-J表達(dá)載體構(gòu)建
            4.2.1.3 rCystatin-J重組蛋白的表達(dá)
        4.2.2 rCystatin-J重組蛋白的純化
            4.2.2.1 表達(dá)產(chǎn)物的純化
            4.2.2.2 腸激酶酶切及目的蛋白純化
        4.2.3 重組蛋白rCystatin-J一步法酸純化
            4.2.3.1 不同醋酸濃度對純化效果的影響
            4.2.3.2 不同處理條件對純化效果的影響
        4.2.4 rCystatin-J的活性檢測
            4.2.4.1 抑菌活性檢測
            4.2.4.2 對cathepsin B的抑制活性檢測
            4.2.4.3 Cystatin對組織蛋白酶B抑制作用的酸堿穩(wěn)定性檢測
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 原核表達(dá)
        4.3.2 蛋白純化
        4.3.3 重組蛋白酸純化
        4.3.4 Cystatin-J的活性檢測
            4.3.4.1 抑菌活性
            4.3.4.2 對cathepsin B的抑制活性檢測
            4.3.4.3 8μM rCystatin-J在不同pH條件下對cathepsin B的抑制率
    4.4 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A 攻讀碩士期間研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]滇池金線鲃（Sinocyclocheilus grahami）與撫仙金線鲃（S.tingi）肌肉營養(yǎng)成分初步分析[J]. 趙亞鵬,潘曉賦,楊君興,陳小勇,李再云,王曉愛.  動物學(xué)研究. 2013(06)
[2]云南滇池瀕危特有種滇池金線鲃人工繁殖初報(英文)[J]. 楊君興,潘曉賦,李再云.  動物學(xué)研究. 2007(03)
[3]滇池土著魚類現(xiàn)狀[J]. 陳自明,楊君興,蘇瑞鳳,陳小勇.  生物多樣性. 2001(04)



本文編號：3390704