為構(gòu)建歐洲鰻鱺噬菌體天然單鏈抗體（scFv）庫(kù),篩選鰻鱺病原菌特異性scFv,本研究采用PCR擴(kuò)增健康歐洲鰻鱺重鏈可變區(qū)（VH）與輕鏈可變區(qū)（VL）基因,通過(guò)重疊延伸PCR（SOE-PCR）技術(shù)擴(kuò)增完整的scFv基因（VH-Linker-VL）序列,與T7噬菌體載體連接,經(jīng)體外包裝后接種于宿主菌BLT5403,增殖后經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得噬菌體scFv庫(kù)。進(jìn)而以嗜水氣單胞菌重組外膜蛋白為抗原,對(duì)噬菌體scFv庫(kù)進(jìn)行4輪生物淘洗,采用阻斷ELISA選取抗體活性最高的scFv,構(gòu)建pGEX-4T-2-OMP-scFv重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進(jìn)行原核表達(dá)。結(jié)果顯示:本研究得到了完整的scFv基因序列,并以此構(gòu)建的噬菌體scFv原始庫(kù)容為1.26×10⁶pfu,經(jīng)擴(kuò)增后初級(jí)庫(kù)滴度為2.8×10⁹pfu/mL;淘洗獲得的嗜水氣單胞菌重組外膜蛋白scFv抑制率最高達(dá)到81.7%,并實(shí)現(xiàn)了該scFv在大腸桿菌中的表達(dá),SDS-PAGE檢測(cè)其蛋白分子量約為53 ku。本研究構(gòu)建的歐洲鰻鱺噬菌體天然scFv庫(kù)及淘選獲得的特異性嗜水氣單胞菌scFv,為養(yǎng)殖鰻... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,42(04)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

歐洲鰻鱺抗體VH、VL及scFv基因的擴(kuò)增產(chǎn)物

取3個(gè)重復(fù)平板中噬菌斑數(shù)量的平均值，通過(guò)公式：滴度（pfu/mL）=對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10，計(jì)算噬菌體scFv庫(kù)滴度。結(jié)果顯示原始噬菌體scFv庫(kù)滴度為42×104×10=4.2×106pfu/mL，庫(kù)容為4.2×106pfu/mL×0.3 mL=1.26×106pfu（圖2A）；擴(kuò)增后得到初級(jí)噬菌體scFv庫(kù)滴度為2.8×109pfu/mL（圖2B）。為進(jìn)一步驗(yàn)證原始噬菌體庫(kù)中scFv基因序列的插入情況，從原始噬菌體scFv庫(kù)的平板中隨機(jī)挑取10個(gè)噬菌斑，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示10個(gè)噬菌斑均擴(kuò)增出約750 bp的scFv基因序列（圖3）。表明scFv基因序列同T7 Select10-3b噬菌體載體的連接效率高，噬菌體scFv庫(kù)已構(gòu)建。圖3 隨機(jī)10個(gè)原始噬菌體scFv庫(kù)噬菌斑的PCR鑒定

隨機(jī)10個(gè)原始噬菌體scFv庫(kù)噬菌斑的PCR鑒定

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本文編號(hào)：3357005