肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及分化有關(guān)的基因主要是作為負(fù)向調(diào)控因子的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因（myostatin,MSTN）和作為正向調(diào)控因子的生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）。MSTN基因?qū)儆谵D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF—β）超家族,其功能是抑制成肌細(xì)胞的過(guò)度增殖,是肌肉發(fā)育的負(fù)調(diào)控基因;生肌調(diào)節(jié)因子家族主要包括Myf5,MyoD,MyoG和MRF4等4個(gè)家族成員,其中MyoD基因是脊椎動(dòng)物肌肉發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控基因之一,對(duì)骨骼肌的形成和分化起主要作用,缺失可導(dǎo)致成肌細(xì)胞的增殖和分化無(wú)法進(jìn)行。魚(yú)類應(yīng)激會(huì)影響肌肉生長(zhǎng),為了解應(yīng)激影響魚(yú)類生長(zhǎng)的機(jī)理,本文以大鱗副泥鰍為研究對(duì)象,分別克隆了大鱗副泥鰍的MSTN基因和MyoD基因的cDNA序列,并對(duì)其進(jìn)行序列分析;運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光光定量PCR技術(shù)分析兩個(gè)基因的組織表達(dá)特異性;檢測(cè)地塞米松應(yīng)激處理后的肌肉組織中MSTN和MyoD基因表達(dá)的劑量和時(shí)間效應(yīng)。主要研究結(jié)果如下:（1）大鱗副泥鰍MSTN基因的cDNA序列長(zhǎng)度為1229bp（GeneBank序列號(hào):KY676785）,編碼375個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為42072.23Da,理論等電點(diǎn)pI=6.82,其氨基酸序列中存在9個(gè)保守... 

【文章來(lái)源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１：?ＭＳＴＮ前體蛋白的結(jié)構(gòu)模式圖（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??－－

含有９個(gè)保守的半胱氨酸殘基來(lái)形成“半胱氨酸節(jié)點(diǎn)”結(jié)構(gòu)，９個(gè)半胱氨酸之間可以??在分子內(nèi)和分子間形成二硫鍵，從而連接形成二聚體，“半胱氨酸節(jié)點(diǎn)”結(jié)構(gòu)在肌肉生??長(zhǎng)抑制素活性功能的形成方面發(fā)揮著重要的作用。ＭＳＴＮ前體蛋白的結(jié)構(gòu)如圖１－１所??示：??Ｐｒｅｐ?ｒｏ－Ｍｙｏｓｔａ?ｔｉｎ?ＲＳＲＲ??ＮＨ２｜Ｓｐ｜?Ｐｒｏ－ｐｅｐｔｉｄｅ?ｄｏｍａｉｎ?｜｜?Ｍａｔｕｒｅ?ｄｏｍａｉｎ?ＩＣＯＯＨ??圖１－１：?ＭＳＴＮ前體蛋白的結(jié)構(gòu)模式圖（Ｊｅａｎ－ＣｈａｒｌｅｓＧａｂｉｎａｒｄ等，２０１３）??Ｆｉｇｌ－１?：?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ＭＳＴＮ?ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ｐｒｏｔｅｉｎ?（Ｊｅａｎ－Ｃｈａｒｌｅｓ?Ｇａｂｉｌｌａｒｄ?ｅｔｃ．，?２０１３）??由ＭＳＴＮ基因編碼合成的肌肉生長(zhǎng)抑制素前體蛋白是沒(méi)有生物活性的，它必須??經(jīng)過(guò)兩次蛋白酶水解剪切過(guò)程之后冰能形成具有生物活性的成熟ＭＳＴＮ蛋白［％。第??一次蛋白酶水解加工的位點(diǎn)在前肽區(qū)和信號(hào)肽之間，在細(xì)胞內(nèi)由ＭＳＴＮ基因編碼形??成的前體蛋白由于信號(hào)肽的作用會(huì)被轉(zhuǎn)膜分泌到細(xì)胞外，但是在轉(zhuǎn)膜分泌到細(xì)胞外之??前會(huì)發(fā)生第一次蛋白酶水解加工而把信號(hào)肽剪切掉。被剪切掉信號(hào)肽的ＭＳＴＮ前體??蛋白，在細(xì)胞外由于前肽區(qū)與成熟肽區(qū)有由４個(gè)氨基酸（ＲＳＲＲ）組成的蛋白酶加工??位點(diǎn)存在，會(huì)第二次被蛋白酶水解加工。ＭＳＴＮ前體蛋白經(jīng)過(guò)兩次蛋白酶水解加工后，??剩下氣基端的前肽（Ｌａｔｅｎｃｙ?ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｐｅｐｔｉｄｅ；?ＬＡＰ）和竣基端由同源二聚體組成的??潛伏態(tài)成熟ＭＳＴＮ蛋白（Ａｃｔｉｖｅ?ｍｙｏｓｔａｔｉｎ?ｄｉｍｅｒ）

３．１總ＲＮＡ質(zhì)量??本實(shí)驗(yàn)利用寶生物公司的ＲＮＡｉｓｏ?Ｐｌｕｓ結(jié)合氯仿等試劑對(duì)大鱗副泥鰍肌肉組織進(jìn)??行總ＲＮＡ提取。圖３－１表示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果：能清晰地看見(jiàn)２８Ｓ和１８Ｓ兩??條帶，且２８Ｓ條帶明顯比１８Ｓ條帶亮，而５Ｓ條帶基本看不見(jiàn)，說(shuō)明本次所提取的總??ＲＮＡ的降解程度很低，完整性較好；利用核酸蛋白分析儀測(cè)定所提取的總ＲＮＡ，結(jié)??果顯示其ＯＤ２６０／２８０平均值為２．０７，說(shuō)明總ＲＮＡ的純度較高。總的來(lái)說(shuō)大鱗副泥鰍??肌肉的總ＲＮＡ純度高，完整性好，用來(lái)作為克�。停樱裕位蚝停停铮幕驎r(shí)的反轉(zhuǎn)??錄模板具有較好的效果。??■一??＿?１８Ｓ??一??圖３－１大鱗副泥鰍肌肉組織總ＲＮＡ?１．５％瓊脂糖凝膠電泳??Ｆｉｇ．３－１?Ｔｈｅ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?Ｐ．?ｄａｂｒｙａｎｕｓ?ｉｎ?１．５％?ａｇａｒｏｕｓ??３．２大鱗副泥鰍ＭＳＴＮ和ＭｙｏＤ基因的ｃＤＮＡ序列??３．２．１?ＭＳＴＮ基因的ｃＤＮＡ序歹ｌｊ??本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一對(duì)特異性引物ＰｄＭＳＴＮ－Ｆｌ和ＰｄＭＳＴＮ－Ｒｌ結(jié)合ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增獲得??了一條７００ｂｐ左右的核苷酸序列，將該序列在ＮＣＢＩ中進(jìn)行ＢＬＡＳＴ比對(duì)后發(fā)現(xiàn)它與??稀有鮑鯽的ＭＳＴＮ基因相似度高達(dá)９１％，與斑馬魚(yú)的ＭＳＴＮ基因相似度也達(dá)到了?８８％，??由此可以確認(rèn)此序列為大鱗副泥鰍ＭＳＴＮ基因的中間片段。由所獲得的中間片段的??核苷酸序列結(jié)合其他幾種鯉形目魚(yú)類ＭＳＴＮ基因的Ｙ端和５＇端的保守序列，設(shè)計(jì)兩??２６??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]黃河裸裂尻魚(yú)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因克隆及表達(dá)分析[J]. 晁燕,趙蘭英,李長(zhǎng)忠,謝保勝,申志新,王國(guó)杰,王振剛,李超,拜彬強(qiáng),張輝,祁得林.  動(dòng)物學(xué)研究. 2012(05)
[2]黃顙魚(yú)MyoD基因的克隆及其表達(dá)[J]. 梁宏偉,李忠,鄒桂偉,劉小林.  武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版). 2012(04)
[3]草魚(yú)兩個(gè)肌肉生長(zhǎng)抑制素cDNA克隆、表達(dá)及過(guò)量表達(dá)對(duì)胚胎發(fā)育的影響[J]. 濮劍威,孫成飛,蔣霞云,鄒曙明.  生物技術(shù)通報(bào). 2011(08)
[4]魚(yú)類應(yīng)激生物學(xué)研究與應(yīng)用[J]. 趙建華,楊德國(guó),陳建武,朱永久,李茜,馮憲斌,何勇鳳,吳興兵.  生命科學(xué). 2011(04)
[5]鳡肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）基因的克隆及其組織特異性表達(dá)分析[J]. 郁建鋒,張營(yíng),王星果,徐建榮,盧祥云,李建林,顧志良.  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2010(10)
[6]奧利亞羅非魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)MyoD1和MyoD2基因特征及差異[J]. 盧中華,俞菊華,李紅霞,李建林,唐永凱,阮瑞霞,楊光.  中國(guó)水產(chǎn)科學(xué). 2010(05)
[7]蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究進(jìn)展[J]. 姜錚,王芳,何湘,劉大偉,陳宣男,趙紅慶,黃留玉,袁靜.  生物技術(shù)通訊. 2009(02)
[8]牙鲆肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）基因克隆[J]. 徐建勇,陳松林.  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2008(04)
[9]眼斑擬石首魚(yú)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因克隆及組織表達(dá)分析[J]. 薛良義,李婷,楊巧一,肖章奎.  海洋學(xué)報(bào)(中文版). 2008(03)
[10]擁擠脅迫對(duì)魚(yú)類影響研究進(jìn)展[J]. 于淼.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(03)

博士論文
[1]草魚(yú)MyoD基因cDNA克隆和表達(dá)研究[D]. 王立新.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2005

碩士論文
[1]斑鱖myostatin基因克隆及其表達(dá)分析[D]. 孫科軍.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[2]草魚(yú)肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）的cDNA克隆及地塞米松對(duì)其表達(dá)的影響[D]. 黃利.西南大學(xué) 2009
[3]豬Smad3、MyoD及GDF-8基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究[D]. 阮井玲.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[4]MyoD、MyoG基因的多態(tài)性及其與雞屠宰性狀和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性研究[D]. 王瓊.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[5]MyoD和DGAT1基因?qū)εｋ伢w性狀影響的分析[D]. 田璐.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3330586