盡管國內(nèi)外學(xué)者們在對蝦細(xì)胞建系上進(jìn)行了大量的探索和不懈的努力，但對蝦細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前仍處于原代培養(yǎng)水平，永生性細(xì)胞系一直未成功建立。而對蝦永生性細(xì)胞系的建立對于研究對蝦病毒的致病機(jī)理和制備病毒疫苗等具有重要科學(xué)意義。在哺乳動物細(xì)胞中，致癌基因的過表達(dá)可成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的永生性轉(zhuǎn)化。翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）是一種重要的細(xì)胞生長相關(guān)蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞生長、抗凋亡和重編程作用。因此，本文擬克隆凡納濱對蝦的TCTP基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體，并通過脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染到對蝦原代培養(yǎng)細(xì)胞中，過表達(dá)，分析其在對蝦細(xì)胞的永生性轉(zhuǎn)化中的作用，為對蝦細(xì)胞的永生性轉(zhuǎn)化奠定技術(shù)基礎(chǔ)。本文首先通過RT-PCR技術(shù)成功克隆得到凡納濱對蝦TCTP基因編碼框的cDNA全長，長度為507bp，編碼168個(gè)氨基酸。以報(bào)告質(zhì)粒pCX-eGFP為模板，PCR擴(kuò)增得到加強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）基因編碼框。然后，以BamHI和EcoRI雙酶切將TCTP基因定向插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-HisA，構(gòu)建得到pcDNA3.1-TCTP重組質(zhì)粒；以KpnI和BamHI雙酶切將eGFP基因定向插入到pcDNA3.1-TCTP重... 

【文章來源】：中國海洋大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

TCTP蛋白結(jié)構(gòu)示意圖(A)及其與Mss4結(jié)構(gòu)(B)的比較

34 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂擴(kuò)增片段。phoresis analysis of PCer. A: Amplifying fragme行測序（華大基因公司v/）上進(jìn)行序列比對，與。Lv-TCTP 基因的核酸和編碼 168 個(gè)氨基酸。

圖 2-3 Lv-TCTP 基因的核酸和氨基酸序列分析結(jié)果。Fig.2-3 Analysis of the nucleic acid and amino acid sequences of Lv-TCTP gene.3.2 去終止密碼子的加強(qiáng)型綠色熒光蛋白（eGFP）基因片段克隆及其序列分析以 pCX-eGFP 質(zhì)粒為模板，以 eGFP 特異性引物，進(jìn)行 eGFP 基因 ORF（去TAA）的 PCR 擴(kuò)增，對其 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果如圖 2-3所示，約在 750 bp 處，有一條清晰的 PCR 產(chǎn)物條帶，該條帶的大小和 eGFP ORF的長度相符合。

【參考文獻(xiàn)】：
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