目的依據(jù)“科赫法則”分離鑒定中華鱉致病菌;探索嗜水氣單胞菌表面抗原的免疫活性;以合適的途徑免疫中華鱉,檢測(cè)中華鱉免疫學(xué)因子和抗病能力的變化,以期篩選到合適的嗜水氣單胞菌共同保護(hù)性抗原。方法（1）通過(guò)生理生化鑒定、毒力因子、16S rRNA及動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)鑒定分離菌;（2）設(shè)計(jì)并合成4對(duì)外膜蛋白特異性引物,構(gòu)建外膜蛋白pET30a原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入BL21中進(jìn)行原核表達(dá);（3）制備嗜水氣單胞菌的主要外膜蛋白,即4種外膜蛋白,注射免疫中華鱉,免疫28天后,取中華鱉血清檢測(cè)抗體效價(jià);免疫28天和免疫35天后,通過(guò)人工攻擊試驗(yàn)檢測(cè)免疫保護(hù)率。結(jié)果（1）分離鑒定到數(shù)株鱉源嗜水氣單胞菌,分離菌氧化酶陽(yáng)性,能利用葡萄糖、麥芽糖等多種糖苷類;具有運(yùn)動(dòng)性;分離菌可檢測(cè)到毒力因子氣溶素和血溶素;（2）成功構(gòu)建4種外膜蛋白的表達(dá)菌株,SDS-PAGE檢測(cè)條帶顯示表達(dá)蛋白大小與預(yù)期蛋白大小一致;（3）所有免疫組都激發(fā)了顯著的體液和非特異性免疫應(yīng)答,在人工攻擊后OmpTS和Omp38起到了有效的免疫保護(hù)作用,但OmpF和Aha1未起到有效的免疫保護(hù)作用。結(jié)論（1）生理生化鑒定、毒力因子及16S rRNA結(jié)果表... 

【文章來(lái)源】：浙江萬(wàn)里學(xué)院浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略詞
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 中華鱉的生物學(xué)特征及疾病概況
        1.1.1 中華鱉的生物學(xué)特征
        1.1.2 中華鱉疾病的概況
    1.2 嗜水氣單胞菌的分類
    1.3 嗜水氣單胞菌的致病性
        1.3.1 流行性
        1.3.2 毒力因子
    1.4 外膜蛋白及其基因
        1.4.1 OmpA蛋白
        1.4.2 微孔蛋白
        1.4.3 脂蛋白
        1.4.4 外膜蛋白的免疫原性
    1.5 對(duì)嗜水氣單胞菌的免疫預(yù)防
    1.6 總結(jié)
第2章 鱉源致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及毒力因子檢測(cè)
    2.1 材料
        2.1.1 材料來(lái)源
        2.1.2 試驗(yàn)用中華鱉
        2.1.3 工具酶及試劑
        2.1.4 常用緩沖液及試劑配制
        2.1.5 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 細(xì)菌的分離
        2.2.2 細(xì)菌形態(tài)特征觀察和理化特性檢查
        2.2.3 細(xì)菌的分子鑒定
        2.2.4 分離菌對(duì)中華鱉的致病力試驗(yàn)
        2.2.5 部分毒力基因檢測(cè)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 病原菌菌落和形態(tài)觀察
        2.3.2 病原菌生理生化特征
        2.3.3 16S rRNA基因序列同源性分析
        2.3.4 人工試驗(yàn)結(jié)果
        2.3.5 Aer、hly基因檢測(cè)結(jié)果
    2.4 討論
第3章 嗜水氣單胞菌主要外膜蛋白的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.1 材料
        3.1.1 菌種及載體
        3.1.2 工具酶及試劑
        3.1.3 常用緩沖液及試劑配制
        3.1.4 主要儀器
    3.2 方法
        3.2.1 引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 目的基因的PCR
        3.2.3 PCR產(chǎn)物純化
        3.2.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.5 質(zhì)粒提取
        3.2.6 酶切與純化
        3.2.7 連接與轉(zhuǎn)化
        3.2.8 嗜水氣單胞菌主要外膜蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá)
        3.2.9 重組蛋白的免疫印跡
        3.2.10 包涵體的純化
        3.2.11 SDS-PAGE電泳
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 外膜蛋白基因的克隆與載體構(gòu)建
        3.3.2 重組外膜蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
        3.3.3 重組外膜蛋白的免疫印跡
    3.4 討論
第4章 嗜水氣單胞菌四種外膜蛋白對(duì)中華鱉的免疫原性
    4.1 材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)用中華鱉
        4.1.2 主要儀器
    4.2 方法
        4.2.1 取血與攻毒實(shí)驗(yàn)
        4.2.2 ELISA檢測(cè)特異性抗體效價(jià)
        4.2.3 免疫印跡
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 抗體效價(jià)的檢測(cè)
        4.3.2 人工攻擊實(shí)驗(yàn)與相對(duì)免疫保護(hù)率
        4.3.3 免疫后中華鱉血清對(duì)重組外膜蛋白的識(shí)別
    4.4 討論
第5章 展望
參考文獻(xiàn)
附錄A
附錄B
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間取得的學(xué)術(shù)成果



本文編號(hào)：3293919