為了實(shí)現(xiàn)異育銀鯽Carassius auratus gibelio腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor,TNF-α）在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效表達(dá),并研究其在促鯽魚細(xì)胞凋亡中的作用,采用PCR的方法從體質(zhì)量（15±1） g異育銀鯽脾臟組織中擴(kuò)增TNF-α基因,構(gòu)建pET28a-TNF-α重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,通過Ni親和層析柱純化并采用尿素濃度梯度透析法進(jìn)行蛋白復(fù)性,最后用rTNF-α蛋白處理鯽魚鰭條細(xì)胞,通過Hoechst 33258染色法和熒光定量PCR技術(shù),分析異育銀鯽經(jīng)rTNF-α蛋白處理后鯽魚細(xì)胞的凋亡情況及凋亡相關(guān)基因Caspase 3和Caspase 8的表達(dá)變化。結(jié)果表明:誘導(dǎo)后獲得了相對分子質(zhì)量約為23 000的蛋白條帶,且重組蛋白以包涵體形式存在;Western-blot顯示,純化產(chǎn)物與抗His單抗在相對分子量約23 000處出現(xiàn)了明顯的反應(yīng)條帶,表明成功地實(shí)現(xiàn)了異育銀鯽TNF-α的重組表達(dá);進(jìn)一步采用Hoechst 33258染色后發(fā)現(xiàn),與正常細(xì)胞相比,經(jīng)rTNF-α蛋白處理后的細(xì)胞核染色加深,呈碎... 

【文章來源】：大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,35(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 異育銀鯽TNF-α基因的擴(kuò)增
        1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.2.3 異育銀鯽TNF-α蛋白的表達(dá)分析
        1.2.4 重組TNF-α蛋白的純化與復(fù)性
        1.2.5 Western-blot 采用濕法轉(zhuǎn)印,將rTNF-α蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上,并用1%
        1.2.6 Hoechst 33258染色
        1.2.7 熒光定量PCR
2 結(jié)果與分析
    2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
    2.2 重組TNF-α蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
    2.3 重組TNF-α蛋白的純化及鑒定
    2.4 Hoechst 33258染色結(jié)果
    2.5 凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化
3 討論
    3.1 異育銀鯽TNF-α的擴(kuò)增及重組表達(dá)
    3.2 重組TNF-α蛋白能誘導(dǎo)鯽魚細(xì)胞發(fā)生凋亡
4 結(jié)論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]草魚TNF-α和IFNγ2的克隆鑒定、重組表達(dá)及生物學(xué)功能的研究[D]. 陳丹燕.電子科技大學(xué) 2012



本文編號：3201816