哺乳動物中,CD6分子作為來自清道夫受體家族的一種淋巴細胞特異性表面受體,在抗炎癥反應以及T細胞激活中具有重要作用,兼顧先天性免疫和適應性免疫調(diào)控。但是,CD6分子在以硬骨魚類為代表的低等脊椎動物中的特性和功能尚不清楚。為探究魚類CD6分子功能,本論文以尼羅羅非魚為對象克隆鑒定了CD6分子（On CD6）及其配體CD166、Syntenin-1、LCP2和TARF6。由此展開了以下4個方面的工作:（1）通過原核表達獲取了On CD6胞外段蛋白,制備單克隆抗體,探究了On CD6分子富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域胞外段蛋白的生物學功能;（2）以羅非魚頭腎淋巴細胞和動物實驗探究了On CD6分子參與炎癥反應的作用機制;（3）通過GST Pull-Down確定了On CD6分子與其配體的互作及互作結(jié)構(gòu)域（4）初步探究了On CD6分子及其配體參與的信號通路。取得的研究結(jié)果如下:1、On CD6分子作為清道夫受體具備模式識別受體的功能本研究成功克隆鑒定了羅非魚CD6基因,該分子定位于淋巴細胞膜上。體外實驗表明On CD6分子胞外段重組蛋白On CD6-ECD在Ca²⁺作用下能夠廣泛識... 

【文章來源】：廣東海洋大學廣東省

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 文獻綜述
    1.1 免疫應答機制概述
        1.1.1 先天性免疫
        1.1.2 適應性免疫
        1.1.3 T細胞激活機制
    1.2 清道夫受體概述
        1.2.1 清道夫受體家族分類
        1.2.2 清道夫受體家族功能
    1.3 CD6的研究進展
        1.3.1 CD6分子結(jié)構(gòu)特征
        1.3.2 CD6分子生理功能
        1.3.3 CD6分子配體概述
    1.4 研究目的和意義
2 OnCD6分子的克隆和表達特征分析
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗用魚
        2.2.2 實驗試劑
        2.2.3 實驗儀器
        2.2.4 實驗引物
    2.3 實驗方法
        2.3.1 實驗用魚及預處理
        2.3.2 總RNA提取和c DNA合成
        2.3.3 OnCD6基因克隆
        2.3.4 OnCD6生物信息學分析
        2.3.5 OnCD6實時熒光定量
        2.3.6 OnCD6胞外段原核表達
        2.3.7 OnCD6單克隆抗體制備方法
        2.3.8 OnCD6亞細胞定位實驗
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 OnCD6的基因克隆和生物信息學分析
        2.4.2 OnCD6的組織分布
        2.4.3 OnCD6在無乳鏈球菌刺激后的表達模式
        2.4.4 OnCD6 在不同刺激物刺激HKLs后的表達模式
        2.4.5 OnCD6在KLH刺激后的表達模式
        2.4.6 OnCD6胞外段的原核表達及純化
        2.4.7 OnCD6的單克隆抗體制備
        2.4.8 OnCD6的亞細胞定位
    2.5 實驗討論
3 OnCD6體外功能驗證
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗細菌
        3.2.2 實驗試劑
        3.2.3 實驗儀器
        3.2.4 實驗引物
    3.3 實驗方法
        3.3.1 OnCD6-ECD與細菌結(jié)合檢測
        3.3.2 OnCD6-ECD與 PAMPs結(jié)合檢測
        3.3.3 OnCD6-ECD誘導細菌凝集檢測
        3.3.4 OnCD6-ECD體外抑菌實驗
        3.3.5 OnCD6-ECD參與吞噬反應檢測
        3.3.6 OnCD6-ECD對 HKLs呼吸爆發(fā)影響的實驗
        3.3.7 OnCD6-ECD對 HKLs炎癥因子表達影響的實驗
        3.3.8 OnCD6-ECD及其單克隆抗體對HKLs增殖影響的實驗
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 OnCD6-ECD參與結(jié)合細菌
        3.4.2 OnCD6-ECD與 PAMPs結(jié)合
        3.4.3 OnCD6-ECD誘導細菌凝集反應
        3.4.4 OnCD6-ECD具有體外抑菌活性
        3.4.5 OnCD6-ECD促進HKLs對細菌吞噬
        3.4.6 OnCD6-ECD對 HKLs呼吸爆發(fā)的影響
        3.4.7 OnCD6-ECD對 HKLs炎癥因子表達的影響
        3.4.8 OnCD6-ECD及其單克隆抗體對HKLs增殖的影響
    3.5 實驗討論
4 OnCD6體內(nèi)功能探究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗用魚
        4.2.2 實驗病菌
        4.2.3 實驗試劑
        4.2.4 實驗設(shè)備
        4.2.5 實驗引物
    4.3 實驗方法
        4.3.1 OnCD6-ECD重組蛋白對感染無乳鏈球菌的羅非魚存活率影響實驗
        4.3.2 OnCD6-ECD重組蛋白對感染無乳鏈球菌的羅非魚載菌量的檢測
        4.3.3 OnCD6-ECD重組蛋白對感染無乳鏈球菌的羅非魚病理生化指標的影響實驗
        4.3.4 CD6體內(nèi)過表達的生物學效應探究實驗
        4.3.5 HE染色
        4.3.6 生化指標檢測
        4.3.7 通路抑制劑孵育HKLs檢測信號通路
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚生存率的影響
        4.4.2 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚載菌量影響
        4.4.3 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚病理變化的影響
        4.4.4 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚外周血生化指標的影響
        4.4.5 OnCD6-ECD重組蛋白對無乳鏈球菌感染羅非魚炎癥因子表達的影響
        4.4.6 OnCD6體內(nèi)過表達驗證結(jié)果
        4.4.7 OnCD6體內(nèi)過表達對無乳鏈球菌感染羅非魚存活率的影響
        4.4.8 OnCD6體內(nèi)過表達對炎癥因子表達的影響
        4.4.9 OnCD6在HKLs中信號通路檢測
    4.5 實驗討論
5 CD6與胞外配體CD166的相互作用探究
    5.1 引言
    5.2 實驗材料
        5.2.1 實驗用魚
        5.2.2 實驗細菌
        5.2.3 實驗試劑
        5.2.4 實驗儀器
        5.2.5 實驗引物
    5.3 實驗方法
        5.3.1 實驗用魚及預處理
        5.3.2 總RNA提取和c DNA合成
        5.3.3 OnCD166基因克隆和生信分析
        5.3.4 OnCD166熒光定量
        5.3.5 OnCD166胞外段原核表達
        5.3.6 OnCD166多克隆抗體的制備實驗
        5.3.7 OnCD166-ECD與細菌結(jié)合檢測
        5.3.8 OnCD166-ECD與 PAMPs結(jié)合檢測
        5.3.9 OnCD166-ECD誘導細菌凝集反應檢測
        5.3.10 GST Pull-Down驗證OnCD166和OnCD6 相互作用
        5.3.11 OnCD166亞細胞定位及共定位實驗
    5.4 實驗結(jié)果
        5.4.1 OnCD166基因克隆與生信分析
        5.4.2 OnCD166 m RNA表達特征
        5.4.3 OnCD166-ECD原核表達
        5.4.4 OnCD166-ECD多克隆抗體制備
        5.4.5 OnCD166-ECD參與細菌結(jié)合
        5.4.6 OnCD166-ECD與 PAMPs結(jié)合
        5.4.7 OnCD166-ECD誘導細菌凝集反應
        5.4.8 OnCD166-OnCD6 互作及相互作用結(jié)構(gòu)域確定
        5.4.9 OnCD166 亞細胞定位及與OnCD6 共定位
    5.5 實驗討論
6 CD6與胞內(nèi)配體的互作及信號通路初探
    6.1 引言
    6.2 實驗材料
        6.2.1 實驗用魚
        6.2.2 實驗試劑
        6.2.3 實驗儀器
        6.2.4 實驗引物
    6.3 實驗方法
        6.3.1 羅非魚Syntenin-1、LCP2和TRAF6 基因克隆及生信分析
        6.3.2 羅非魚Syntenin-1、LCP2和TRAF6 熒光定量
        6.3.3 羅非魚Syntenin-1、LCP2和TRAF6 原核表達
        6.3.4 抗體封閉實驗
        6.3.5 GSTPull-Down驗證OnCD6與Syntenin-1、LCP2和TRAF6 互作
        6.3.6 雙熒光素酶報告基因檢測實驗
    6.4 實驗結(jié)果
        6.4.1 羅非魚Syntenin-1 基因克隆及生信分析
        6.4.2 羅非魚LCP2基因克隆和生信分析
        6.4.3 羅非魚TRAF6基因克隆和生信分析
        6.4.4 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 m RNA表達特征
        6.4.5 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6原核表達及純化
        6.4.6 抗體封閉實驗結(jié)果
        6.4.7 OnCD6-ICD與 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 互作
        6.4.8 OnCD6、OnCD166和On TRAF6 參與的信號通路
    6.5 實驗討論
7 全文總結(jié)與展望
    7.1 全文總結(jié)
    7.2 后續(xù)展望
參考文獻
附錄Ⅰ GST標簽包涵體蛋白變性條件下表達、純化和復性
附錄Ⅱ His標簽包涵體蛋白變性條件下表達、純化和復性
致謝
作者簡介
導師簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]魚類免疫應答機制研究進展[J]. 白姍姍,賈智英,石連玉.  水產(chǎn)學雜志. 2017(04)
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[3]無乳鏈球菌誘導吉富羅非魚分泌型免疫球蛋白M（sIgM）重鏈基因的克隆及原核表達[J]. 王培,魯義善,王蓓,湯菊芬,蔡佳,吳灶和,簡紀常.  生物技術(shù)通報. 2014(02)
[4]PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特點及其識別特異性配體的機制[J]. 李華,林葵,吳更.  中國生物化學與分子生物學報. 2011(12)
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博士論文
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[3]感染無乳鏈球菌尼羅羅非魚脾臟的病理學研究[D]. 賀揚.四川農(nóng)業(yè)大學 2017
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[5]草魚白細胞介素1β誘導表達的負調(diào)控機制及其在炎癥反應中的意義[D]. 楊瀟.電子科技大學 2014
[6]羅非魚無乳鏈球菌病病原學、病理學及cpsE基因的原核表達研究[D]. 黃錦爐.四川農(nóng)業(yè)大學 2012
[7]河豚清道夫受體的基因鑒定及其在炎癥反應中的功能研究[D]. 孟真.浙江大學 2011
[8]魚類Th細胞標志分子的克隆與功能研究及Th細胞的初步鑒定[D]. 鞏永鳳.浙江大學 2009
[9]HAb18G/CD147分子調(diào)控T細胞活化與免疫突觸形成[D]. 胡勁松.第四軍醫(yī)大學 2008
[10]應激對黃顙魚非特異性免疫細胞的影響[D]. 劉小玲.華中農(nóng)業(yè)大學 2006

碩士論文
[1]無乳鏈球菌和海豚鏈球菌滅活疫苗對羅非魚的免疫效果[D]. 付天增.山東農(nóng)業(yè)大學 2017
[2]尼羅羅非魚T細胞激活相關(guān)基因的功能研究[D]. 甘楨.廣東海洋大學 2015
[3]棕點石斑魚中草藥免疫增強劑的篩選及其非特異性免疫增強效果研究[D]. 孫曉飛.海南大學 2014
[4]SAMHD1單克隆抗體的制備及其初步應用[D]. 戈曼.東北農(nóng)業(yè)大學 2013
[5]紅笛鯛重組激活基因克隆及表達分析[D]. 張雪利.廣東海洋大學 2012
[6]對蝦腸道益生菌的篩選與免疫物質(zhì)活性評價指標的建立[D]. 李海兵.中國海洋大學 2008



本文編號：3183720