我國淡水珍珠產量自上世紀80年代初以來一直處于世界領先地位,三角帆蚌（Hypriosis20cumingii）是最主要育珠蚌。三角帆蚌所產珍珠珠質光滑細膩,顏色鮮艷多樣。珍珠顏色影響珍珠價值。珍珠顏色受到供片蚌珍珠層顏色的影響。外泌體參與貝殼形成,外泌體是否參與貝殼珍珠層顏色形成值得關注。本研究以實驗室構建的三角帆蚌紫色（貝殼珍珠層為紫色）與白色（貝殼珍珠層為白色）家系為實驗材料,通過miRNA與蛋白質組測序技術對外套膜外泌體在貝殼珍珠層顏色形成過程中的作用進行了研究。主要結果如下:1.三角帆蚌白色與紫色家系外套膜外泌體提取、鑒定及miRNA表達譜分析首次成功提取三角帆蚌白色與紫色家系外套膜外泌體。使用電鏡鑒定外泌體形態(tài)為茶托樣,粒徑分布分析表明白色與紫色家系外泌體直徑分別為175.2±5.120nm及176.1±5.4nm。對兩種外泌體small20RNA文庫進行高通量測序與表達譜分析。通過與miRbase20V21數據庫比對,在白色與紫色家系外套膜外泌體中分別獲得了136個與159個miRNA。使用|log2（Fold20change）|≥2,且20p20value≤0.0520的... 

【文章來源】：上海海洋大學上海市

【文章頁數】：110 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
第一章 文獻綜述
    1. 貝殼的形成與結構
    2. 珍珠層顏色研究進展
        2.1 金屬元素致色
        2.2 有機物致色
        2.3 珍珠層結構致色
    3. 外泌體研究進展
    4. 本研究的目的與意義
第二章 三角帆蚌白色與紫色家系外套膜外泌體的提取、鑒定及miRNA表達譜分析
    第一節(jié) 不同殼色三角帆蚌外套膜外泌的提取、鑒定
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
            1.2 實驗方法
                1.2.1 外套膜組織外泌體的提取
                1.2.2 外泌體的電鏡鑒定(TEM)
                1.2.3 外泌體的納米顆粒追蹤分析檢測(NTA)
        2 結果
            2.1 外泌體電鏡觀察與粒徑分布
        3 討論
    第二節(jié) 不同殼色三角帆蚌外套膜外泌的miRNA表達譜分析
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
            1.2 實驗方法
                1.2.1 總RNA的提取
                1.2.2 兩種殼色三角帆蚌外套膜外泌體miRNA文庫構建與測序
                1.2.3 差異表達miRNA的qPCR驗證
        2 結果
            2.1 不同殼色三角帆蚌外套膜外泌體miRNA測序質量分析
            2.2 差異表達miRNAs分析及qPCR驗證
        3 討論
第三章 外泌體miRNA對三角帆蚌珍珠層顏色形成相關基因的調控作用
    第一節(jié) miR-15b調控三角帆蚌hcApo基因
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
            1.2 實驗方法
                1.2.1 雙熒光素酶報告載體構建
                1.2.2 293T細胞的培養(yǎng)及轉染
                1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測
                1.2.4 三角帆蚌中miR-15b的抑制
                1.2.5 miR-15b的組織表達
                1.2.6 hcApo基因的組織定量分析
        2 結果
            2.1 雙熒光素酶報告基因檢測分析
            2.2 miR-15b與hcApo基因的組織表達分析
        3 討論
    第二節(jié) miR-4504調控三角帆蚌HcMitf基因
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
            1.2 實驗方法
                1.2.1 雙熒光素酶報告載體構建
                1.2.2 293T 細胞的培養(yǎng)與轉染
                1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測
                1.2.4 三角帆蚌中miR-4504的抑制
                1.2.5 miR-4504的組織表達
                1.2.6 HcMitf與HcTyr基因的組織定量分析
                1.2.7 外套膜組織酪氨酸酶活性檢測
                1.2.8 外套膜組織黑色素含量檢測
                1.2.9 數據統(tǒng)計與分析
        2 結果
            2.1 雙熒光素酶報告基因檢測分析
            2.2 miR-4504、HcMitf及其下游基因HcTyr的組織表達分析
            2.3 外套膜組織酪氨酸酶活性與黑色素含量
        3 討論
第四章 三角帆蚌白色與紫色家系外套膜外泌體蛋白組學分析
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 實驗方法
            1.2.1 外套膜組織外泌體提取
            1.2.2 外泌體電鏡鑒定與納米顆粒追蹤分析
            1.2.3 外泌體總蛋白提取
            1.2.4 TMT標記
            1.2.5 高效液相色譜分級
            1.2.6 液相色譜-串聯(lián)質譜分析
            1.2.7 質譜數據分析
            1.2.8 生物信息學分析
            1.2.9 通過PRM驗證差異表達蛋白
    2 結果
        2.1 外套膜外泌體的鑒定
        2.2 蛋白質譜與功能注釋
        2.3 差異蛋白鑒定與富集分析
        2.4 差異表達蛋白的PRM驗證
    3 討論
第五章 三角帆蚌珍珠層顏色形成相關基因的克隆與表達分析
    第一節(jié) 三角帆蚌鐵蛋白基因HcFerritin的克隆與表達分析
        1 材料與方法
            1.1 實驗材料
            1.2 實驗方法
                1.2.1 總RNA提取以及HcFerritin基因克隆
                1.2.2 HcFerritin基因序列分析
                1.2.3 HcFerritin基因組織特異性表達分析
                1.2.4 原位雜交
                1.2.5 鐵脅迫對HcFerritin基因的表達分析
        2 結果
            2.1 HcFerritin基因的克隆與序列分析
            2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析
            2.3 HcFerritin基因的組織表達分析
            2.4 原位雜交結果
            2.5 鐵脅迫后HcFerritin基因的表達分析
        3 討論
    第二節(jié) 三角帆蚌糞卟啉原Ⅲ氧化酶基因HcCPOX的克隆與表達分析
        1 實驗材料與方法
            1.1 實驗材料
            1.2 實驗方法
                1.2.1 總RNA提取以及HcCPOX基因克隆
                1.2.2 HcCPOX基因序列分析
                1.2.3 HcCPOX基因組織特異性表達分析
                1.2.4 原位雜交
                1.2.5 組織糞卟啉原Ⅲ氧化酶活性檢測
                1.2.6 RNA干擾
        2 結果
            2.1 HcCPOX基因的克隆與序列分析
            2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析
            2.3 HcCPOX基因的組織表達分析
            2.4 原位雜交
            2.5 組織糞卟啉原Ⅲ氧化酶活性檢測
            2.6 RNA干擾后檢測
        3 討論
結論
參考文獻
附錄
博士期間科研成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[2]三角帆蚌酪氨酸酶相關基因克隆及對珍珠層顏色影響研究[D]. 陳夏君.上海海洋大學 2017
[3]三角帆蚌供片蚌對珍珠質量的影響[D]. 劉越.上海海洋大學 2013
[4]蝦青素對馬氏珠母貝的影響研究[D]. 馬孝甜.廣東海洋大學 2012
[5]三角帆蚌兩種貝殼珍珠質顏色對珍珠顏色影響的研究[D]. 朱文彬.上海海洋大學 2011
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本文編號：3178343