自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子（Naturalkillerenhancingfactor,NKEF）于1993年在人類的紅細(xì)胞中被分離純化，成為了Peroxiredoxin（Prx）抗氧化蛋白家族一個(gè)重要的成員。因?yàn)樵隗w外可以增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，所以被命名為自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子。為了研究硬骨魚中NKEF的免疫防御機(jī)制，在本篇論文中，我們采用快速擴(kuò)增cDNA末端（rapidamplificationofcDNAends,RACE）的方法，經(jīng)過(guò)凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆子的檢測(cè)和測(cè)序后，得到鮸魚NKEF-A全長(zhǎng)cDNA序列。鮸魚NKEF-AcDNA全長(zhǎng)為1235bp，其中包括47bp的5’非翻譯區(qū)，597bp的開放閱讀框和591bp的3’非翻譯區(qū)，整個(gè)開放閱讀框編碼198個(gè)氨基酸。鮸魚NKEF-A的蛋白分子量約為23kDa，在其蛋白質(zhì)序列中，含有三個(gè)半胱氨酸殘基（Cys），其中第52位和173位上的半胱氨酸殘基分別存在于兩個(gè)高度保守的VCP信號(hào)上，通過(guò)比對(duì)其他幾種I類抗氧化蛋白家族成員后，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位置的半胱氨酸殘基也是非常保守的，并且是Prx家族蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能的氨基酸... 

【文章來(lái)源】：浙江海洋大學(xué)浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 ROS簡(jiǎn)述
        1.1.1 ROS的概念
        1.1.2 ROS產(chǎn)生的途徑
        1.1.3 ROS的功能
        1.1.4 ROS的消除
    1.2 Prx家族概述
        1.2.1 Prx家族的分類概況
        1.2.2 Prx蛋白家族的功能及作用機(jī)制
    1.3 自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子
        1.3.1 NKEF的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 魚類NKEF基因的發(fā)現(xiàn)及克隆
        1.3.3 NKEF的生物學(xué)功能
    1.4 鮸魚NKEF基因研究的意義
第二章 鮸魚NKEF基因的克隆
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料采集
        2.1.2 DNA/RNA的提取及cDNA的合成
        2.1.3 引物設(shè)計(jì)
        2.1.4 擴(kuò)增鮸魚NKEF-A基因
        2.1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化
        2.1.6 目的片段的連接轉(zhuǎn)化
        2.1.7 菌落PCR檢測(cè)及測(cè)序
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.2.1 DNA/RNA的提取
        2.2.2 鮸魚NKEF-A基因的克隆
        2.2.3 鮸魚NKEF-A基因的序列拼裝與提交
        2.2.4 鮸魚NKEF-A基因結(jié)構(gòu)分析
        2.2.5 鮸魚NKEF-A氨基酸序列比對(duì)分析
        2.2.6 鮸魚NKEF-A進(jìn)化樹構(gòu)建
    2.3 討論
        2.3.1 鮸魚NKEF-A基因的克隆
        2.3.2 鮸魚NKEF-A基因氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹
第三章 鮸魚NKEF-A基因的表達(dá)分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料的采集
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.1 NKEF-A基因在鮸魚不同組織中的表達(dá)
        3.2.2 鰻弧菌侵染后NKEF-A基因在組織中的表達(dá)
    3.3 討論
第四章 鮸魚NKEF-A基因蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備
    4.1 鮸魚克隆載體pMD-NKEF-A質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.1 材料和方法
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.2 重組表達(dá)載體pET-NKEF質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.3 重組質(zhì)粒pET-NKEF的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.3.1 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.4 多克隆抗體制備
        4.4.1 實(shí)驗(yàn)方法
        4.4.2 Westernblot分析
        4.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.5 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果
附表


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]抗氧化蛋白Peroxiredoxin家族研究進(jìn)展[J]. 章波,向渝梅,白云.  生理科學(xué)進(jìn)展. 2004(04)
[2]鰻弧菌滅活疫苗對(duì)牙鲆免疫效果的研究[J]. 高冬梅,李健,王群.  海洋水產(chǎn)研究. 2004(01)
[3]鰻弧菌感染牙鲆的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察[J]. 夏永娟,黃威權(quán),姜國(guó)良.  海洋科學(xué). 2000(10)
[4]鱸魚苗爛鰓、爛尾病病原菌的研究[J]. 肖慧,李軍,王祥紅,紀(jì)偉尚,徐懷恕.  青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 1999(01)



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