肌肉內(nèi)的脂肪含量在調(diào)控魚(yú)類肌肉品質(zhì)上發(fā)揮著重要作用,在一定范圍內(nèi)如何增加肌肉內(nèi)的脂肪含量來(lái)達(dá)到改善肌肉的嫩度和風(fēng)味等特性的目的是養(yǎng)殖業(yè)中熱門(mén)的研究課題之一。肌肉生長(zhǎng)抑制素myostatin屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）超家族中的一員,負(fù)調(diào)控動(dòng)物體骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育水平。前人研究證實(shí)mstn參與調(diào)控骨骼肌等組織中的多種代謝過(guò)程如脂肪代謝、糖代謝等。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究mstn參與肌肉內(nèi)脂肪代謝過(guò)程相關(guān)機(jī)制及功能作用。通過(guò)構(gòu)建mstn敲除型泥鰍和構(gòu)建mstn敲降胖頭鯉細(xì)胞系模型,從活體和離體兩方面來(lái)研究肌肉組織及肌肉細(xì)胞中脂肪代謝的情況來(lái)探究mstn在其中發(fā)揮的作用,并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白免疫印跡、Oil Red O染色、H&E染色、脂質(zhì)組學(xué)研究等多種生化、細(xì)胞和分子檢測(cè)方法研究其作用與機(jī)制。獲得的主要結(jié)果如下:（1）.mstn基因缺失能顯著促進(jìn)肌肉組織發(fā)育,但在促進(jìn)肌肉組織發(fā)育的同時(shí),會(huì)減少肌肉組織中的脂肪合成,LC-MS分析表明mstn缺失顯著影響了泥鰍肌肉組織中的脂質(zhì)組分,甘油三酯含量顯著減少,此外,還發(fā)現(xiàn)mstn缺失型泥鰍肌肉組織中ATP含量明顯低于野生型,因此猜測(cè)mstn調(diào)控... 

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【部分圖文】：

泥鰍mstn基因（mRNA）不同組織中的表達(dá)分析

mstn基因降低魚(yú)類脂肪沉積的作用研究17蛋白質(zhì)的編碼產(chǎn)生的影響可能更大，具體的靶位點(diǎn)序列如下：靶位點(diǎn)：5’-GGACCAGTACGGTGTGCTGG-3’靶位點(diǎn)與一段特定的序列結(jié)合合成特異性gRNA的PCR正向引物，序列如下：gRNA-F：TGTAATACGACTCACTATAGGACCAGTACGGTGTGCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATgRNA-R：AAAGCACCGACTCGGTGCCA3.2.2敲除模型的成功構(gòu)建如圖2.2為泥鰍mstn的突變模型，靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)于第一外顯子，通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序篩選泥鰍突變類型，測(cè)序峰圖如圖顯示，該突變是mstn基因第一個(gè)外顯子核苷酸位置287的T到G過(guò)渡，使得MSTN蛋白第95位密碼子的翻譯過(guò)早導(dǎo)致突變，我們將此種突變定義為MU。圖2.2通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建泥鰍mstn突變模型Fig2.1MSTN-depletionloaches(MUforshort)producedbyCRISPR/Cas93.3qPCR和WesternBlot檢測(cè)mstn基因表達(dá)為了分析mstn基因的敲除效果，通過(guò)在cDNA序列上設(shè)計(jì)定量引物及自制兔多克隆抗體分別從mRNA及蛋白水平檢測(cè)了mstn基因表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果如圖2.3所示。從qPCR結(jié)果分析得出與對(duì)照組野生型泥鰍相比，MU泥鰍mstn基因mRNA的表達(dá)量顯著降低（2.3A）；Westernblot結(jié)果也證明了MU型泥鰍mstn基因的蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（2.3B）。檢測(cè)結(jié)果分析表示我們成功獲得了mstn基因敲除的二倍體泥鰍模型。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士研究生學(xué)位論文18AB圖2.3mstn基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)分析。（A）MU與WT泥鰍肌肉組織mstn基因的mRNA的表達(dá)分析；（B）WesternBlot分析敲除型與野生型泥鰍肌肉組織中mstn基因蛋白的表達(dá)。Fig2.3(A)TranscriptionalexpressionlevelsofmusclemstninWT(F1wild-typeloaches)andMU.(B)MSTNproteinlevelsinmuscletissuesofWTandMU.3.4mstn缺失對(duì)泥鰍生長(zhǎng)發(fā)育的影響將mstn缺失的突變型泥鰍與野生型對(duì)照組泥鰍按照嚴(yán)格統(tǒng)一的方式養(yǎng)殖，每15尾養(yǎng)殖于15L的白色魚(yú)缸中，保持28°C循環(huán)水喂養(yǎng)，光/暗周期為14h/10h，一日三次投喂，定時(shí)定量投喂鮮活水蚯蚓，定期換水，分別在30d、60d、90d、120d生長(zhǎng)期下記錄泥鰍體長(zhǎng)體重情況，并做好拍照工作，從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，mstn缺失型泥鰍的肌肉發(fā)育程度顯著強(qiáng)于對(duì)照組泥鰍，90d時(shí)的對(duì)比情況如圖2.4A所示。與此同時(shí)，mstn缺失對(duì)泥鰍體長(zhǎng)并無(wú)顯著影響，但是對(duì)體重以及體高有著明顯的促進(jìn)作用，如果2.4B所示。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]魚(yú)類脂肪酸β-氧化研究進(jìn)展[J]. 寧麗軍,李加敏,孫勝香,杜震宇.  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2019(01)
[2]不同脂肪源對(duì)泥鰍稚魚(yú)生長(zhǎng)性能及脂肪酸組成的影響[J]. 高堅(jiān),李洋,葉偉釗,王衛(wèi)民,曹小娟.  水生生物學(xué)報(bào). 2016(01)
[3]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)動(dòng)物中的應(yīng)用[J]. 幸宇云,楊強(qiáng),任軍.  遺傳. 2016(03)
[4]一種新的基因敲除術(shù)-RNAi[J]. 李穎平,張映,邵國(guó)青.  生物技術(shù)通報(bào). 2006(03)
[5]RNAi技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用[J]. 尹秀山,張令強(qiáng),賀福初.  遺傳. 2006(03)



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