牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我國重要的經(jīng)濟(jì)海水養(yǎng)殖魚類之一,其肉質(zhì)鮮美,蛋白質(zhì)含量高,具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,此外,牙鲆的生長速率具有明顯的性別差異,單性養(yǎng)殖可以有效地提高經(jīng)濟(jì)效益。精巢發(fā)育是行有性生殖動物繁殖的基礎(chǔ),而精子發(fā)生則是精巢正常發(fā)育的關(guān)鍵。精子發(fā)生主要指二倍體精原細(xì)胞通過減數(shù)分裂等一系列復(fù)雜的生化反應(yīng),進(jìn)而產(chǎn)生成熟的單倍體精子的過程。盡管我們對精子發(fā)生的理解有了長足的進(jìn)步,相關(guān)基因和化學(xué)物質(zhì)的研究也不斷被發(fā)現(xiàn)和鑒定,但目前,關(guān)于牙鲆性腺發(fā)育和精子發(fā)生的研究多集中于性激素和性別分化相關(guān)基因的表達(dá)分析方面。此外,性腺發(fā)育和精子發(fā)生相關(guān)基因的研究又多集中于這些編碼基因的表達(dá)規(guī)律和功能分析,對其轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控研究鮮有報(bào)道,而該領(lǐng)域正是目前遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期通過高通量測序等技術(shù)建立了牙鲆精巢和卵巢miRNA文庫,并篩選出一批在雌雄性腺中差異表達(dá)的miRNA,其中,miR-202-5p是性腺中豐富表達(dá),且雌雄表達(dá)差異顯著的一個(gè)miRNA。在此基礎(chǔ)上,本研究采用熒光定量PCR和原位雜交技術(shù)構(gòu)建miR-202-5p在牙鲆不同組織和性腺發(fā)育過程中的表達(dá)譜。結(jié)... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1 牙鲆簡介
    2 牙鲆性腺及性腺相關(guān)基因研究
    3 MicroRNA簡介
        3.1 MicroRNA的合成機(jī)制和特征
        3.2 MicroRNA的作用機(jī)制
        3.3 MicroRNA的表達(dá)檢測方法
    4 MicroRNA在水產(chǎn)動物精巢中的作用及研究進(jìn)展
    5 MiR-202-5p在精巢中的研究進(jìn)展
    6 本研究的目的與意義
第一章 MiR-202-5p在牙鲆性腺中的表達(dá)分析
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)魚
        1.2 試劑
        1.3 溶液配制
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 總RNA提取
        2.2 熒光定量PCR分析miR-202-5p的組織表達(dá)
            2.2.1 引物設(shè)計(jì)
            2.2.2 牙鲆各組織及不同時(shí)期性腺組織cDNA合成
            2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.3 原位雜交技術(shù)分析miR-202-5p在牙鲆性腺中的定位表達(dá)
            2.3.1 石蠟切片
            2.3.2 H.E.染色
            2.3.3 PCR擴(kuò)增vasa非編碼區(qū)
            2.3.4 PCR產(chǎn)物膠回收
            2.3.5 TA克隆
            2.3.6 轉(zhuǎn)化反應(yīng)
            2.3.7 藍(lán)白斑篩選和測序
            2.3.8 質(zhì)粒提取
            2.3.9 體外合成RNA探針
            2.3.10 MiR-202-5p反義探針
            2.3.11 化學(xué)原位雜交
            2.3.12 熒光原位雜交
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 總RNA提取
        3.2 MiR-202-5p在牙鲆各組織和不同發(fā)育時(shí)期性腺中的定量表達(dá)
        3.3 MiR-202-5p在牙鲆精巢、卵巢中的定位表達(dá)
    4 討論
第二章 視黃酸與miR-202-5p作用關(guān)系研究
    1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 視黃酸溶液配制
        2.2 視黃酸活體注射
        2.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
        2.4 引物設(shè)計(jì)
        2.5 熒光定量PCR
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 視黃酸與miR-202-5p的作用關(guān)系
        3.2 視黃酸與精巢發(fā)育精子發(fā)生相關(guān)基因的作用關(guān)系
    4 討論
第三章 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及miRNA靶基因鑒定
    1 實(shí)驗(yàn)材料
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 MiR-202-5p靶基因預(yù)測
        2.2 Ccnd1和cbx2 3'UTR引物設(shè)計(jì)
        2.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒
            2.3.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
            2.3.2 Ccnd1和cbx2 3'UTR區(qū)克隆
            2.3.3 轉(zhuǎn)化子菌液質(zhì)粒小提
            2.3.4 雙酶切質(zhì)粒
            2.3.5 連接和轉(zhuǎn)化
        2.4 靶位點(diǎn)驗(yàn)證
            2.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
            2.4.2 熒光活性檢測及數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果
        3.1 靶基因的預(yù)測及載體構(gòu)建
        3.2 靶基因驗(yàn)證
    4 討論
第四章 在精巢和原代生殖細(xì)胞水平miR-202-5p對 ccnd1和cbx2 表達(dá)的影響
    1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 牙鲆精巢組織體外培養(yǎng)
        2.2 牙鲆原代生殖細(xì)胞培養(yǎng)及純化
        2.3 MiR-202-5p mimics和 antagomir轉(zhuǎn)染
            2.3.1 MiR-202-5p mimics和 antagomir轉(zhuǎn)染精巢組織
            2.3.2 MiR-202-5p mimics和 antagomir轉(zhuǎn)染原代生殖細(xì)胞
        2.4 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
        2.5 熒光定量PCR
    3 結(jié)果
        3.1 原代生殖細(xì)胞純化
        3.2 轉(zhuǎn)染mimics和 antagomir的精巢組織中miR-202-5p的表達(dá)
        3.3 轉(zhuǎn)染mimics和 antagomir的精巢組織中cbx2和ccnd1 的表達(dá)
        3.4 轉(zhuǎn)染mimics和 antagomir的原代生殖細(xì)胞中miR-202-5p的表達(dá)
        3.5 轉(zhuǎn)染mimics和 antagomir的原代生殖細(xì)胞中cbx2和ccnd1 的表達(dá)
    4 討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文
致謝



本文編號：3065001