過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)輔助激活因子1α(PPARγcoactivator-1α,PGC-1α)是一個(gè)重要的能量調(diào)節(jié)因子,不僅能調(diào)控生命活動(dòng)基本的代謝活動(dòng)如脂質(zhì)和糖類(lèi)的代謝,同時(shí)也能調(diào)節(jié)線粒體的生物合成并行使正常的功能。PGC-1α的分布范圍十分廣泛,在(brown adipose tissue,BAT)褐色脂肪組織、心臟、大腦、肝臟、肌肉等多個(gè)組織中均能檢測(cè)到其表達(dá),且在不同類(lèi)型組織中具有不同的表達(dá)量。PGC-1α基因的結(jié)構(gòu)包含C端的轉(zhuǎn)錄激活域、中間的轉(zhuǎn)錄抑制域、一個(gè)富含絲氨酸及精氨酸殘基的模體結(jié)構(gòu)以及N端的RNA結(jié)合域。作為一個(gè)參與各個(gè)生理生化過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控分子,PGC-1α被認(rèn)為是機(jī)體或細(xì)胞外部信號(hào)的主要感受器。它能被諸多因素激活:1.活性氧類(lèi)和活性氮類(lèi)物質(zhì)(ROS)和(RNS)。這兩者均為細(xì)胞內(nèi)源性的代謝副產(chǎn)物,當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí),上述兩種活性物質(zhì)的含量均上升;2.低溫誘導(dǎo)。當(dāng)機(jī)體暴露在冷環(huán)境中,PGC-1α的表達(dá)量顯著性上升,通過(guò)促進(jìn)機(jī)體的適應(yīng)性產(chǎn)熱以適應(yīng)低溫環(huán)境造成的影響;3.鍛煉、長(zhǎng)時(shí)間的耐力型訓(xùn)練均能引起PGC-1α的表達(dá)量升高。此外還有多種重要的信號(hào)通路參與調(diào)控PGC-1α的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。PGC-1α最初被發(fā)現(xiàn)是由于其在寒冷暴露下,在棕色脂肪中作為一個(gè)冷誘導(dǎo)調(diào)控因子能增加適應(yīng)性產(chǎn)熱。哺乳動(dòng)物暴露在寒冷環(huán)境中,其作為恒溫動(dòng)物主要通過(guò)骨骼肌顫栗、增加有氧呼吸產(chǎn)生ATP和熱量以維持低溫下正常的生理活動(dòng);當(dāng)植物暴露于寒冷環(huán)境中,蛋白質(zhì)和核酸構(gòu)象發(fā)生改變、細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低,主要通過(guò)增加冷誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)量從而引起下游信號(hào)通路以適應(yīng)低溫。關(guān)于PGC-1α在機(jī)體受到低溫刺激過(guò)程中所起作用的相關(guān)的研究主要集中于哺乳動(dòng)物模型,而其功能在魚(yú)類(lèi)中鮮有報(bào)道。因此本研究以斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞ZF4細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?通過(guò)構(gòu)建慢病毒載體并轉(zhuǎn)染ZF4細(xì)胞,以干擾細(xì)胞內(nèi)源性的PGC-1α的表達(dá)量;并利用嘌呤霉素篩選獲得PGC-1α敲降的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并給與其18°C、10°C不同程度和不同時(shí)間的低溫刺激,以探究PGC-1α在ZF4冷應(yīng)激過(guò)程中所起的功能。野生型的斑馬魚(yú)ZF4細(xì)胞18°C 1~7 d的低溫處理后,PGC-1α的mRNA表達(dá)量較28°C正常溫度下生長(zhǎng)的細(xì)胞顯著性上升。以上證實(shí)低溫刺激誘導(dǎo)ZF4細(xì)胞內(nèi)PGC-1α的表達(dá)量升高。為探究低溫刺激下PGC-1α對(duì)ZF4細(xì)胞所起的功能,本研究根據(jù)NCBI網(wǎng)站上斑馬魚(yú)PGC-1α基因的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)了PGC-1α的4個(gè)shRNA:分別對(duì)應(yīng)其CDS區(qū)第165、457、1486、2487位堿基起始長(zhǎng)度為21 bp的片段。轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒后,ZF4細(xì)胞中PGC-1α的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),4個(gè)敲降位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的敲降比例分別為43%、38%、25%和50%,故選擇轉(zhuǎn)染PGC-1α-shRNA4的細(xì)胞作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)組。本研究分為三組:空白對(duì)照組(pLKO.DEST.EGFP)、陰性對(duì)照組(pLKO.1-shNC)和實(shí)驗(yàn)組(pLKO.1-shRNA)。將以上三組細(xì)胞分別在18°C和10°C處理1d、4d、7d后用,通過(guò)CM-H2DCFDA探針染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組、PGC-1α-shNC和PGC-1α-sh4三組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平發(fā)現(xiàn),在28°C時(shí),PGC-1α敲降不影響細(xì)胞內(nèi)ROS的含量;而給予ZF4細(xì)胞18°C不同時(shí)間的低溫刺激后,PGC-1α敲降組(PGC-1α-sh4)細(xì)胞內(nèi)的ROS含量高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組:18°C 1 d(0.93±0.03 vs 0.79±0.03,p0.001)、18°C4 d(2.10±0.15 vs 1.24±0.06,p0.01)和18°C 7 d(4.00±0.16 vs 2.87±0.15,p0.01)。ZF4細(xì)胞10°C處理1 d、4 d、7 d后,ROS的表達(dá)量增加并且隨著冷處理時(shí)間的延長(zhǎng),ROS在細(xì)胞內(nèi)有累積的趨勢(shì)。這也從側(cè)面反應(yīng)在低溫刺激下,PGC-1α能使體內(nèi)ROS含量維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平范圍內(nèi),從而減緩低溫下產(chǎn)生的ROS對(duì)細(xì)胞造成的損傷。線粒體有氧呼吸伴隨著ROS的產(chǎn)生,如果ROS在細(xì)胞內(nèi)大量的積累,那么首先會(huì)危害到產(chǎn)生ROS的場(chǎng)所——線粒體。因此,我們又采用JC-1染色,通過(guò)BD C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)到PGC-1α敲降后的ZF4細(xì)胞經(jīng)冷處理后其線粒體膜電位(MMP)發(fā)生顯著性降低。正常情況下,膜電位正常的細(xì)胞占所有細(xì)胞的99%以上,而低溫處理后,細(xì)胞的膜電位會(huì)發(fā)生一定程度的下降,PGC-1α敲除后細(xì)胞的膜電位下降加劇。同時(shí),PGC-1α敲降的細(xì)胞在MMP下降后繼而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡的現(xiàn)象,其中早期凋亡的細(xì)胞所占的比例較PGC-1α未敲除的細(xì)胞顯著性上升。另一方面,bax(促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡的蛋白)和bcl-2(抵抗細(xì)胞凋亡發(fā)生的蛋白)兩者的比率在PGC-1α敲降的細(xì)胞中顯著性減小,bax的蛋白水平顯著性升高,與之相反bcl-2的蛋白水平顯著性降低,說(shuō)明PGC-1α敲降后給予ZF4細(xì)胞低溫刺激繼而引發(fā)細(xì)胞凋亡。綜上所述,冷應(yīng)激過(guò)程中PGC-1α的敲降會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,線粒體中MMP下降,bax蛋白的表達(dá)升高而bcl-2的表達(dá)降低,引發(fā)內(nèi)源性的由線粒體為中心而引發(fā)的細(xì)胞凋亡通路。這也從另一個(gè)角度證明了PGC-1α在ZF4細(xì)胞受到冷刺激后能保護(hù)其免受低溫的危害,能通過(guò)維持ZF4細(xì)胞內(nèi)的ROS水平和MMP以適應(yīng)冷應(yīng)激產(chǎn)生的一系列應(yīng)答反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S917.4
【部分圖文】：

圖 1-1 PGC-1 家族中共激活因子的結(jié)構(gòu)和功能[18]家族中 PGC-1α、PGC-1β 和 PRC 的序列相似性比較。三種 PGC-1 家結(jié)構(gòu)域：標(biāo)注紅色的為激活區(qū)域，標(biāo)注黃色的為富含 Arg / Ser 結(jié)bingding domin。 PGC-1α 和 PGC-1β 具有相似的結(jié)構(gòu)域，這些區(qū)域活區(qū)域(40%)、中間的轉(zhuǎn)錄區(qū)域(35%)和 C 端的 RNA 結(jié)合區(qū)域(48C-1α 結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物。 PGC-1α 分別在氨基和羧基末端與 HA復(fù)合物結(jié)合。 SirT1 和 p160 與阻遏結(jié)構(gòu)域結(jié)合，其還包含三個(gè) p磷酸化位點(diǎn)。Figure 1-1 Structure and function of coactivators in the PGC-1 family.son of sequence similarities of PGC-1α, PGC-1β, and PRC in the PGC-1 PGC-1 family members have the following three domains: the red-labelellow-enriched Arg/Ser domain, and the purple-labeled RNA-binding doβ have similar domains, and these regions are mainly the N-terminal actintermediate transcription region (35%) and the C-terminal RNAbindingB) Protein complexes that bind to PGC-1α. PGC-1α binds to the HAT an/intermediator complexes at the amino and carboxyl ends, respectively. Sression domain that also contains three p38 MAP kinase phosphorylation

圖 1-2 PGC-1 家族在幾種重要的脊椎動(dòng)物中的保守性[18]（Clustal）對(duì) GenBank 中目前 PGC-1 家族中存在的已知的氨在某些物種中缺少某些成員可能是由于可用數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏全長(zhǎng) ure 1-2 Conservation of PGC-1 Family in Several Important Verteblustal software to compare the sequence of known amino acids pres in GenBank. The lack of certain members in some species may be dfull-length cDNAsequences in available databases. 的功能α 與線粒體生物合成 DNA 復(fù)制和增殖受到 PGC-1α 的直接調(diào)控。有研究發(fā)位表達(dá) PGC-1α，能直接促進(jìn)線粒體生物合成的增加。另吸轉(zhuǎn)錄激活因子 1 和 2(Nuclear respiratoryfactor1 and

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 PGC-1α 的小鼠中，心肌細(xì)胞中的線粒體數(shù)目明顯增多。此外，PG活并提高 NRF-1 的表達(dá)量，通過(guò)介導(dǎo) UCP-2 的合成促進(jìn)心肌細(xì)胞中成。雖然在 PGC-1α 過(guò)表達(dá)的組織中存在著線粒體數(shù)量顯著上升的現(xiàn)因子與這些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之間發(fā)生互作，PGC-1α 的敲除小鼠仍然存常的線粒體豐度[26]。因此，PGC-1α 對(duì)于小鼠線粒體的正常發(fā)育不是當(dāng)置于生理壓力下時(shí)，與具有正常水平的 PGC-1α 的小鼠相比，這些受性降低[27]。類(lèi)似地，在 PGC-1β 破壞的基因敲除小鼠中，小鼠顯體功能正常水平，并且適應(yīng)生理應(yīng)激的能力降低。然而，PGC-1α/β 產(chǎn)生了大多數(shù)在 24 小時(shí)內(nèi)因心臟組織線粒體缺陷而導(dǎo)致死亡的小鼠結(jié)果說(shuō)明 PGC-1α 和 PGC-1β 兩者單獨(dú)敲除后不影響細(xì)胞執(zhí)行線粒體力，但它們能夠在生理應(yīng)激期間相互補(bǔ)償以獲得最佳的線粒體數(shù)量
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;高通量細(xì)胞轉(zhuǎn)染設(shè)備獲全球創(chuàng)新百大獎(jiǎng)[J];泰州科技;2012年08期

2 唐蓓;;一種穩(wěn)定且高效的磷酸鈣293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染法[J];生物技術(shù);2011年01期

3 徐海明;蔣稼歡;;微流控技術(shù)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用[J];生物工程學(xué)報(bào);2011年10期

4 張榮華;王冰;;哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)概述[J];大家健康(學(xué)術(shù)版);2013年17期

5 姜云霞;王冰;崔韶暉;趙軼男;楊寶靈;段艷;王秀武;張樹(shù)彪;;陽(yáng)離子脂質(zhì)體基因載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年17期

6 黎萬(wàn)玲;王槐志;倪兵;姜曼;吳玉章;;磁轉(zhuǎn)聯(lián)合脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)高效細(xì)胞轉(zhuǎn)染[J];免疫學(xué)雜志;2005年06期

7 哈小琴,吳祖澤,張慶林,吳彬,呂同德;質(zhì)粒超螺旋比例對(duì)其細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及表達(dá)的影響[J];生物技術(shù)通訊;2005年04期

8 雷撼,吳國(guó)明,周向東,黃桂君,錢(qián)桂生,徐長(zhǎng)榮,蔣文,鄭輝;新型細(xì)胞轉(zhuǎn)染素—N~4-精胺膽固醇羰酰氨的合成[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年04期

9 劉燕;朱吉海;孫偉;趙珺;;細(xì)胞轉(zhuǎn)染中單克隆與混克隆干擾基因效率的比較[J];青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2016年04期

10 邱燁;;提高Lipofectamine2000對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的研究[J];中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2014年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 林曉岐;人IL-2基因的克隆及哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1991年

2 劉世洲;TopBP1蛋白在細(xì)胞DNA損傷中的作用機(jī)制[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2006年

3 韓婕;體外實(shí)驗(yàn)探討miR-638對(duì)脂質(zhì)代謝的影響[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2017年

4 吳雄輝;非病毒型載體介導(dǎo)SOD1基因體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];中南大學(xué);2011年

5 趙夢(mèng)丹;靶向納米載體介導(dǎo)基因治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效及機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2017年

6 孫愛(ài);大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）三種組織細(xì)胞系的建立、鑒定及其應(yīng)用的初步研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2010年

7 吳運(yùn)東;陽(yáng)離子聚合物基因載體的合成及其性能研究[D];湖南大學(xué);2013年

8 陳景波;小鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植治療去神經(jīng)節(jié)巨結(jié)腸實(shí)驗(yàn)研究[D];華中科技大學(xué);2009年

9 王保祥;Gadd45 α 異常甲基化在食管鱗癌中的研究[D];中南大學(xué);2012年

10 李萬(wàn)勝;人IL-8基因在卵巢上皮性癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中作用機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 胡成楓;PGC-1α在斑馬魚(yú)細(xì)胞冷應(yīng)激過(guò)程中的功能探究[D];上海海洋大學(xué);2018年

2 甘利鵬;LncRNA TCONS_00179042對(duì)PRRSV在Marc-145細(xì)胞中復(fù)制的影響[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

3 馬驍;銜接蛋白在狂犬病毒入侵細(xì)胞過(guò)程中作用的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

4 華艷芳;降低SFRS10基因表達(dá)對(duì)小鼠AML-12細(xì)胞中SIRT1和Lipin-1表達(dá)水平的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2017年

5 張慶慧;PAM14的細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)和定位[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2008年

6 閆巧霞;納米載體攜載外源基因進(jìn)行體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2015年

7 孫達(dá)權(quán);山羊乳腺特異性載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

8 徐娟;成年山羊乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染人乳鐵蛋白基因及細(xì)胞株的建立[D];揚(yáng)州大學(xué);2006年

9 張頻;雞TIA-1和G3BP1在應(yīng)激顆粒形成和抗病毒反應(yīng)過(guò)程中的作用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

10 王君實(shí);沉默PLIN1基因與楊梅素聯(lián)合作用對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂解的影響及機(jī)制探究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2884358