本研究以齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)為對象,對食欲調(diào)節(jié)因子和mTOR信號通路在魚類攝食調(diào)控中的作用和機制進(jìn)行了初步探討。試驗首先克隆齊口裂腹魚食欲調(diào)節(jié)基因(apelin,APJ,proglucagon和NUCB2)和mTOR信號通路基因(mTOR,S6K1,S6,4E-BPl,4E-BP2和4E-BP3);繼而采用實時熒光定量PCR的方法,檢測它們在齊口裂腹魚17種組織中的分布情況;分析食欲調(diào)節(jié)基因在不同攝食狀態(tài)下的表達(dá)模式;最后研究腹腔注射mTOR的激動劑(亮氨酸,L-leu)和抑制劑(雷帕霉素,RAPA)對齊口裂腹魚攝食量以及食欲調(diào)節(jié)基因和mTOR信號通路基因表達(dá)的影響。1.齊口裂腹魚食欲調(diào)節(jié)基因克隆、組織分布和不同攝食狀態(tài)下的表達(dá)研究本試驗克隆得到齊口裂腹魚食欲調(diào)節(jié)基因:apelincDNA全長1001bp,編碼77個氨基酸,包含22個氨基酸的信號肽;Apelin受體一APJ cDNA核心片段1080 bp,編碼359個氨基酸,具有7個跨膜結(jié)構(gòu)域;proglucagon cDNA核心片段504 bp,編碼121個氨基酸,包含21個氨基酸的信號肽;NUCB2 cDNA全長2140 bp,編碼487個氨基酸,包含23個氨基酸的信號肽。Apelin及其受體APJ mRNA在齊口裂腹魚的各組織廣泛表達(dá),表達(dá)模式基本一致,主要表達(dá)部位是心臟、脾臟和腦。proglucagon mRNA主要在腸道和腦表達(dá),其它組織表達(dá)量較低。NUCB2mRNA主要表達(dá)部位是肝胰臟,其它組織也廣泛表達(dá)。攝食后1小時和3小時,齊口裂腹魚下丘腦apelin和APJ mRNA表達(dá)水平顯著降低(P0.05),腸道和下丘腦proglucagon和NUCB2 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P0.05,P0.01)。禁食7天內(nèi),下丘腦apelinmRNA水平顯著升高(P0.05),下丘腦 proglucagon 和 NUCB2 及腸道proglucagon mRNA 水平顯著降低(P0.05,P0.01),而肝胰臟NUCB2 mRNA水平顯著升高(P0.01);3天禁食顯著增加APJ mRNA表達(dá)(P0.05),但是禁食5天和7天的APJ mRNA表達(dá)與對照組無顯著差異(P0.05)。復(fù)投喂當(dāng)天,apelin和APJmRNA水平顯著低于按時投喂的對照組(P0.05),復(fù)投喂第3天,二者均恢復(fù)到正常水平;復(fù)投喂后,proglucagon和NUCB2mRNA表達(dá)與對照組均無顯著差異。結(jié)果提示:apelin和APJ作為促食欲因子,proglucagon和NUCB2作為飽食因子參與齊口裂腹魚的攝食調(diào)控。2.齊口裂腹魚mTOR信號通路基因克隆、組織分布和攝食調(diào)控機制初探本試驗克隆得到齊口裂腹魚mTOR信號通路基因:mTOR cDNA全長8046 bp,編碼2515個氨基酸;S6K1 cDNA核心片段1084 bp,編碼310個氨基酸;S6 cDNA全長860 bp,編碼249個氨基酸;4E-BP1核心片段363 bp,編碼120個氨基酸;4E-BP2核心片段342 bp,編碼113個氨基酸;4E-BP3核心片段336 bp,編碼111個氨基酸。序列比對發(fā)現(xiàn),mTOR信號通路基因的氨基酸序列在脊椎動物間均高度保守。組織分布結(jié)果表明,mTOR信號通路基因在齊口裂腹魚各組織均高度而廣泛的表達(dá)。提示mTOR信號通路基因在不同組織中可能發(fā)揮多重生物學(xué)功能。與對照組相比,腹腔注射4小時后,RAPA(lmg/kgBW)可顯著增加齊口裂腹魚的攝食量(P0.05),L-leu(10mg/kgBW)降低攝食量不顯著(P0.05)。腹腔注射L-leu和RAPA對齊口裂腹魚mTOR信號通路基因mRNA表達(dá)的影響大多不顯著(P0.05)。但是,腹腔注射L-leu后,肝胰臟和腸道ghrelinmRNA水平分別下降至對照組的1/8和2/5(P0.05);腹腔注射RAPA后,下丘腦、肝胰臟和腸ghrelin mRNA水平分別是對照組的1.4倍、5倍和16倍(P0.05)。此外,注射L-leu上調(diào)了下丘腦POMC和NPY,肝胰臟NUCB2、leptin和CCK,及腸NUCB2的表達(dá)水平(P0.05);下調(diào)下丘腦AgRP的表達(dá)水平(P0.05)。注射RAPA下調(diào)了下丘腦POMC和AgRP的表達(dá)水平(P0.05),上調(diào)腸proglucagon和CCK的表達(dá)水平(P0.05)。注射L-leu和RAPA都不影響下丘腦apelin、APJ、NUCB2和CRH的表達(dá)水平。結(jié)果提示:腹腔注射L-leu(10mg/kgBW)和RAPA(1mg/kgBW)4小時后,齊口裂腹魚攝食調(diào)控與ghrelin和POMC基因表達(dá)水平改變有關(guān),與mTOR信號通路基因轉(zhuǎn)錄水平無關(guān)。綜合上述結(jié)果,得到如下結(jié)論:apelin和APJ作為齊口裂腹魚促食欲因子,proglucagon和NUCB2作為飽食因子參與攝食調(diào)控。腹腔注射L-leu(10 mg/kgBW)和RAPA(1 mg/kgBW)4小時后改變ghrelin和POMC基因表達(dá),從而調(diào)控齊口裂腹魚攝食。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

在差異ｍＴＯＲＣｌ對ＲＡＰＡ極其敏感，主要通過對氨基酸、應(yīng)激、氧氣、能量和??生長因子等信號輸入產(chǎn)生應(yīng)答效應(yīng)，誘發(fā)合成代謝過程和抑制分解代謝過程來促進(jìn)細(xì)??胞生長，驅(qū)動細(xì)胞周期進(jìn)程ｍＴＯＲＣ２對急性的ＲＡＰＡ處理不敏感，但是長期暴??露在其中能夠破壞它的結(jié)構(gòu)，主要通過對生長因子產(chǎn)生應(yīng)答效應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞存活和新??陳代謝Ｗ及細(xì)胞骨架肌動蛋白的重新組裝??２．２．３巧巧化位點??蛋白磯酸化是蛋白激酶將踞酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特定底物蛋白上的共價修飾過程，調(diào)控??蛋白質(zhì)的酶學(xué)活性或生物學(xué)功能。蛋白激酶分為二類，即絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶和??酪氨酸蛋白激酶。ｍＴＯＲ是在真核生物間高度保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，其復(fù)??合體能夠高度磯酸化，通過質(zhì)譜法可Ｗ分析蛋白質(zhì)的憐酸化位點１４３１。目前，ｍＴＯＲ??被確認(rèn)的麟酸化位點有?６?個；Ｓｅｒ＇ｗ、Ｓｅ戶５９、Ｔｈｒ２＾、Ｔｈｒ＾６、Ｓｅｒ２ｗ和?Ｓｅｒ２ｗＷ＂＊８ｌ。??Ｓｅｒｉｗ位于Ｎ－端的ＨＥＡＴ重復(fù)序列，Ｓｅｒ２ｉ５９和Ｔｈｒ２＾位于激酶域，其余３個位點均??位于Ｃ－端的負(fù)調(diào)節(jié)域（見圖１－２）。??……?…?Ｓ針?１２６１?ＴｈｒＷＭ?３＾４８１??

３．３齊口裂腹魚ＮＵＣＢ２基因的組織表達(dá)模式??ＮＵＣＢ２在齊口裂腹魚的各組織中廣泛表達(dá)。主要表達(dá)組織為齊曰裂腹魚的肝膜??，其余組織均檢測到ＮＵＣＢ２表達(dá)；瓊脂糖凝膠電泳圖顯示ＮＵＣＢ２的組織表達(dá)模??與實時焚光定量ＰＣ民檢測結(jié)果一致（見圖２－１３）。??曼?１－２??Ｉ?１??＆?０．８?ｉ??＜??含?０．６?．．??！?：?１?ｈ?ｉ，ｉ?ｒ出??１?興４戶車。、＊氣々沁＞＾咬受＾護(hù)。４滬??次＜？?＾?Ａ??ＮＵＣＢ２?｜＾ｙ＾ｌ２３ＤＢＱＢＳＢＢ！Ｅ３ＢＳＢ５ＥＳＤＢＥ９??

在垂體、皮膚和腸道等組織中表達(dá)較低（見圖２－１０和２－１１）。??Ｓ?１．２?１??〇??Ｉ?．１１??Ｓ?０．６?－?＾?Ｉ??Ｉ。Ｉ?Ｉ??１ＩＩ?｜｜＿｜｜．．．１．．．．??弁、＊氣。次Ｖ會＊夢汝戶??去。９?於，？＜／?成，??兇２－１０齊口裂腹魚叩ｅｌｉｎ的紀(jì)織特異性表達(dá)（ｎ＝１０）??Ｆｉｇ．?２－１０?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ａｐｅｌｉｎ?ｍＲＮＡ?ｉｎ?扣片ｂｏ化ｏｒｏｘｆ化內(nèi)口０＇?ｔｉｓｓｕｅｓ??１．２?］??Ｉ?１?Ｔ?Ｔ??苗１－??Ｗ?０．８?－??Ｉ？？ｕ??聲�！�?聲、弟冷公??冷??兇２－ｎ齊口裂腹魚ＡＰＪ的組織特異性表達(dá)（ｎ＝１０）??Ｆｉｇ．?２－１１?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ］?ｅ邱ｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＡＰＪ?ｍＲＮＡ?ｉｎ?ＳｃＡｂｏ／／／ｏｒａｘ／？ｒｅ＂幻＂ｔｉｓｓｕｅｓ??２．３．２齊□裂腹魚ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ基因的組織表達(dá)模式??如圖２－１２所示，ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ主要在齊口裂腹魚的腸道和腦中表達(dá)。在肝族臟、??脾臟、腎臟和性腺中檢測少量表達(dá)，在也臟、垂體、魄和紅肌中有微弱表達(dá)，白肌、??皮膚和眼中幾乎檢測不到其表達(dá)。??２５??
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