發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 19:36

　　 目的 CD4為重要的淋巴細(xì)胞表面分子,屬于免疫球蛋白家族膜錨定蛋白,與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合,參與Th細(xì)胞TCR識別抗原的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),產(chǎn)生相關(guān)免疫應(yīng)答。草魚是我國主要養(yǎng)殖魚類,也是低等脊椎動(dòng)物中硬骨魚類的代表物種,對其免疫系統(tǒng)的研究有助于了解免疫系統(tǒng)的多樣性以及脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的進(jìn)化,也可為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病害防治提供理論依據(jù)。本研究旨在制備抗草魚CD4L-2單克隆抗體,并分選出CD4L-2+細(xì)胞,為T細(xì)胞亞群分類及其功能研究奠定基礎(chǔ)。方法基于轉(zhuǎn)錄組測序獲得的草魚CD4L-2基因信息設(shè)計(jì)特異引物,采用PCR技術(shù)分離草魚腸道CD4L-2基因：應(yīng)用qPCR方法分析草魚CD4L-2基因的表達(dá)譜。原核表達(dá)抗原性較強(qiáng)的CD4L-2胞外段蛋白,以重組蛋白免疫小鼠獲多抗；雜交瘤技術(shù)制備相應(yīng)的mAb,并利用CIK細(xì)胞間接免疫熒光、Western blot、間接ELISA等方法檢測其特異度與效價(jià)。采用Protein G親和色譜法純化抗草魚CD4L-2的mAb,IAC技術(shù)純化獲得CIK細(xì)胞內(nèi)靶蛋白,質(zhì)譜分析靶蛋白與預(yù)測的草魚CD4L-2蛋白的一致性。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分選檢測用PHA刺激草魚前后的各免疫相關(guān)組織中CD4L-2+細(xì)胞比例變化特征；激光共聚焦鑒定草魚腸粘膜中表達(dá)CD4L-2基因的細(xì)胞類型。結(jié)果草魚CD4L-2基因的ORF長1290 bp,編碼429個(gè)氨基酸,分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)三部分。胞外區(qū)含有3個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域(V1-C1-C2),胞質(zhì)區(qū)包含保守的CXC基序。該CD4L-2分子胞外區(qū)存在多個(gè)保守性位點(diǎn),如C1結(jié)構(gòu)域中的WTC基序以及V1、C1和C2結(jié)構(gòu)域中的N-糖基化位點(diǎn)等。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,草魚CD4L-2與斑馬魚、日本關(guān)東鯽、斑點(diǎn)叉尾鮰等魚類的親緣關(guān)系較近,草魚CD4L-2基因表達(dá)于各種組織,表達(dá)量從高到低的順序?yàn)檠�、體腎、心臟、頭腎、腸道、脾臟、鰓、胸腺、肝臟、鰭、肌肉、表皮等組織,也表達(dá)于腎細(xì)胞(CIK)中。獲得的抗草魚CD4L-2多抗與單抗的效價(jià)分別為1：64000與1：160000(雜交瘤細(xì)胞的保藏號為：CCTCCC2015189)。CIK細(xì)胞間接免疫熒光與Western blot分析結(jié)果顯示,所制備的抗草魚CD4L-2單克隆抗體能特異性識別自然狀態(tài)下折疊的CD4L-2蛋白。質(zhì)譜分析顯示,靶蛋白與預(yù)測的草魚CD4L-2蛋白的一致性可達(dá)66%。健康草魚多數(shù)組織中含有CD4L-2+細(xì)胞,其在組織細(xì)胞中的百分比從高到低的順序?yàn)樾叵�、鰓、肝臟、腸道、脾臟、頭腎、體腎、血液,其中,胸腺的CD4L-2+細(xì)胞含量極顯著地高于血液與體腎(p0.01),鰓、肝臟和腸道中CD4L-2+細(xì)胞含量顯著高于血液與體腎(p0.05)。用PHA刺激48 h后,各免疫相關(guān)組織中CD4L-2+細(xì)胞比例發(fā)生了明顯變化,其中,頭腎、脾臟、肝臟與腸道中CD4L-2+細(xì)胞比例顯著升高,而胸腺中CD4L-2-細(xì)胞比例有所下降。激光共聚焦分析顯示,腸粘膜中嗜酸性細(xì)胞、嗜中性細(xì)咆、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等均為CD4L-2-細(xì)胞。結(jié)論 本研究克隆了草魚CD4L-2基因,制備并鑒定了抗草魚CD4L-2單克隆抗體,探明了草魚CD4L-2-細(xì)胞在相關(guān)組織中的分布特征,初步明確了草魚腸粘膜中表達(dá)CD4L-2+的細(xì)胞類型。鑒于CD4+T細(xì)胞在獲得性免疫系統(tǒng)中的作用,抗草魚CD4L-2單克隆抗體的獲得,為魚類T細(xì)胞亞群的分類及功能研究奠定丁基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
前言
第一章 草魚CD4L-2基因的克隆與表達(dá)
    第一節(jié) 草魚CD4L-2的分子克隆和原核表達(dá)
        1 材料與方法
        2 結(jié)果
        3 討論
    第二節(jié) 草魚CD4L-2基因表達(dá)分析
        1 材料與方法
        2 結(jié)果
        3 討論
第二章 抗草魚CD4L-2單克隆抗體的制備及鑒定
    第一節(jié) 抗草魚CD4L-2多克隆抗體的制備
        1 材料與方法
        2 結(jié)果
        3 討論
    第二節(jié) 抗草魚CD4L-2單克隆抗體的制備
        1 材料與方法
        2 結(jié)果
        3 討論
    第三節(jié) 單克隆抗體的純化及固相化
        1 材料與方法
        2 結(jié)果
        3 討論
    第四節(jié) 抗草魚CD4L-2單克隆抗體的鑒定
        1 材料與方法
        2 結(jié)果
        3 討論
第三章 草魚CD4L-2+細(xì)胞鑒定分析
    1 材料與方法
    2 結(jié)果
    3 討論
全文結(jié)論
文獻(xiàn)綜述
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間本人公開發(fā)表的論文
致謝

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1 柳昭君;抗草魚CD4L-2單克隆抗體的制備及其應(yīng)用研究[D];蘇州大學(xué);2016年

本文編號：2876875