紅鯽因其擁有鮮艷的紅色體色而備受人們喜愛,是具有重要觀賞價(jià)值的觀賞魚品種之一。然而,紅鯽在體色發(fā)育過程中存在“青轉(zhuǎn)紅”的現(xiàn)象,即黑色素細(xì)胞先增加后減少,體色由青灰色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色的現(xiàn)象。探究這種“青轉(zhuǎn)紅”現(xiàn)象的遺傳分子調(diào)控機(jī)制,有利于人們更好地理解黑色素細(xì)胞發(fā)育的分子遺傳機(jī)理。因此,本研究利用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了紅鯽不同體色發(fā)育時(shí)期皮膚組織中基因表達(dá)信息,通過高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合MethylRAD甲基化測(cè)序技術(shù)研究了成體紅鯽與白鯽皮膚組織中基因表達(dá)信息和DNA甲基化位點(diǎn)信息,同時(shí)利用了 CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)和過表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建技術(shù)探究了體色發(fā)育相關(guān)基因的具體功能。具體研究結(jié)果如下:1.通過組織學(xué)觀察技術(shù),我們跟蹤研究了紅鯽體色發(fā)育的各個(gè)時(shí)期中色素細(xì)胞的組成和變化情況,發(fā)現(xiàn)黑色素細(xì)胞最早出現(xiàn)在受精后48h(hpf),孵化出膜后1天(ldph)時(shí)黃色素細(xì)胞在頭部出現(xiàn),7dph左右虹彩細(xì)胞在腹部少量出現(xiàn);胚胎及幼苗紅鯽體表黑色素細(xì)胞逐漸增多,45～60d左右紅鯽體表黑色素細(xì)胞開始凝集減少,大約在90d左右黑色素細(xì)胞完全消褪,此時(shí)黃色素細(xì)胞與紅色素細(xì)胞逐漸增多,最后紅鯽通體呈現(xiàn)出紅色體色。2.通過RNA-Seq技術(shù)首次獲得了紅鯽變色前(GC)、變色中(CV)和變色后(RC)這三個(gè)不同體色發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組信息,分別得到了103,229、108,208和120,184個(gè)轉(zhuǎn)錄本。通過SNP序列分析,分別得到了 187,616、191,213和218,780個(gè)SNP位點(diǎn)。通過生物信息學(xué)分析顯示,在CV和GC、RC和CV、RC和GC之間分別存在2483、2967和4473個(gè)差異表達(dá)基因。這些差異表達(dá)基因的一部分參與了色素合成的信號(hào)通路,如黑色素生成通路中的基因(Mitfa、Pax3a、Foxd3、Mclr、Asip),酪氨酸代謝基因(Tyr、Dct、Tyrp1、Silva、Tat、Hpda)和Pteridine代謝基因(Gch1、Xdh、Ptps、Tc)等。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和qPCR檢測(cè)結(jié)果均表明,Mitfa與Tyr、Tyrp1、Dct、Tfe3a和Baxa等重要色素發(fā)育基因與紅鯽“青轉(zhuǎn)紅”體色變遷密切相關(guān);Mitfa扣可能作為主控基因通過調(diào)控黑色素合成或黑素細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的基因表達(dá)在紅鯽體色形成中起著重要作用。3.通過高通量技術(shù)研究了成體紅鯽與白鯽皮膚組織基因表達(dá)信息,組裝后分別得到了 56,564和56,612條Unigenes,紅鯽與白鯽存在7117個(gè)差異表達(dá)基因,其中3434個(gè)基因在紅鯽中高表達(dá),3683個(gè)基因在白鯽中高表達(dá),通過qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),黑色素合成相關(guān)基因如Tyr、Dct、Tyrp1和Mc1r在紅鯽皮膚中低表達(dá),而其他色素合成相關(guān)基因如Foxd3、Hpda、Ptps、Gchl和Sox9b則在紅鯽皮膚中高表達(dá)。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),在黑色素合成信號(hào)通路、糖異生和酪氨酸代謝等信號(hào)通路中存在大量差異表達(dá)基因的富集。4.通過MethylRAD甲基化測(cè)序技術(shù)研究了成體紅鯽與白鯽皮膚中DNA甲基化位點(diǎn)信息,在紅鯽與白鯽皮膚中分別得到了 17,147,966和16,568,891個(gè)甲基化標(biāo)簽,比對(duì)率分別為21.45%和18.08%。在紅鯽與白鯽中分別得到了 96,122和88,536個(gè)CCGG甲基化位點(diǎn),其平均深度分別為30.71和28.35;分別得到了 7,961和9,534個(gè)CCWGG甲基化位點(diǎn),其平均深度分別為9.18和9.02。發(fā)現(xiàn)在色素發(fā)育相關(guān)基因如Tyr、Dct、Foxd3、Mitfa和Hpda等基因中均存在差異甲基化位點(diǎn)。通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)在MAPK信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、黑色素合成和Hippo等信號(hào)通路中存在大量差異甲基化基因,這些結(jié)果表明DNA甲基化在鯽魚體色形成過程中起著重要作用。5.通過CRISPR/Cas9基因敲除與過表達(dá)載體技術(shù),在紅斑馬魚敲除了黑色素細(xì)胞調(diào)控基因Mitfa,發(fā)現(xiàn)Mitfa基因突變會(huì)導(dǎo)致紅斑馬魚早期皮膚黑色素細(xì)胞缺失,過表達(dá)Mitfa發(fā)現(xiàn)其在早期能夠增加黑色素細(xì)胞的表達(dá),但不能拯救黑色素細(xì)胞最終的消退。綜上所述,本研究利用高通量RNA-Seq技術(shù)在紅鯽不同體色發(fā)育時(shí)期,獲得了大量的差異表達(dá)基因和SNP位點(diǎn)信息,分析結(jié)果表明了在紅鯽體色發(fā)育中Mitfa為主控基因調(diào)控Tyr和Dct等基因的表達(dá),通過黑色素合成代謝途徑調(diào)控著紅鯽“青轉(zhuǎn)紅”的體色轉(zhuǎn)變。Mitfa基因敲除與過表達(dá)分析進(jìn)一步證實(shí)了Mitfa基因?qū)︳~類黑色素細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)控功能。利用RNA-Seq和MethylRAD技術(shù)比較分析了成體紅鯽與白鯽皮膚組織中差異表達(dá)基因與DNA甲基化位點(diǎn)信息,證實(shí)了黑色素合成關(guān)鍵酶Tyr基因的甲基化水平與體色密切關(guān)聯(lián)。本研究中所獲得的大量轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和DNA甲基化位點(diǎn)信息,為進(jìn)一步揭示魚類體色發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了分子遺傳學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

?素細(xì)胞。在４８ｈｐｆ時(shí)，眼色素出現(xiàn)，之后黑色素細(xì)胞在頭部，背部和腹部相繼增??加（圖２－１，Ａ）；在５６ｈｐｆ時(shí)黑色素逐漸分布在紅鯽全身（圖２－１，Ｂ）；在７０ｈｐｆ時(shí)??在頭部和背部可以觀察到一些黃色素細(xì)胞，７２ｈｐｆ左右卵膜破裂，此時(shí)紅鯽出膜??（圖２－１，Ｃ）。在紅鯽出膜后３ｄ左右可以觀察有魚鰾出現(xiàn)，在７ｄｐｈ左右在腹部出??現(xiàn)一些虹彩細(xì)胞（圖２－１，Ｄ），同時(shí)在尾部也觀察到有黃色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞和??黑色素細(xì)胞（圖２－１，Ｆ）。在適宜的溫度和ＰＨ環(huán)境下，紅舞有一部分幼魚在６０ｄｐｈ??左右，黑色素細(xì)胞開始從背部脫落，呈現(xiàn)出淡黃色的表型（圖２－１，Ｇ，Ｈ）。最后??在９０ｄ左右大部分紅鯽黑色素細(xì)胞褪去呈現(xiàn)出橙色體色，最后逐漸變成紅色體色??（圖?２－１，Ｉ）。??ＡＢＣ??ｉｔｓ．??＿?—??ｊｆｆ??－??Ｇ?Ｈ?Ｉ??ｒ?ｔ??圖２－１紅鯽不同體色發(fā)育時(shí)期體色觀察．Ａ：４８ｈｐｆ（４ｘ）；?Ｂ：４８ｈｐｆ（ｌ〇ｘ）；?Ｃ：?０ｄｐｈ（２０ｘ）；??Ｄ：７ｄｐｈ（２〇ｘ）；?Ｅ：７ｄｐｈ（２〇ｘ）；?Ｆ：?７ｄｐｈ（２〇ｘ）；?Ｇ：變色前（４０ｄ）；?Ｈ：變色中（６０ｄ）；?Ｉ：變色后（９０ｄ）。??其中Ｍ代表黑色素細(xì)胞

?織中色素細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。其中在青灰色（ＧＣ）時(shí)期（ａ）、體色改變（ＣＶ）時(shí)期（ｂ）??和變色后紅色（ＲＣ）時(shí)期（ｃ）的幼魚（圖２－２，?ａ，ｂ，ｃ）。在紅鯽４０ｄｐｈ時(shí)，背部皮膚??組織中黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞同時(shí)存在，且黑色素細(xì)胞既有黑色素活躍的分枝??狀又有黑色素細(xì)胞凝集態(tài)的圓形態(tài)；此時(shí)黃色素細(xì)胞也存在著分枝態(tài)和圓形態(tài)，??但大多分布在頭背部（圖２－２，?ｄ）；通過透射電鏡觀察黑色素細(xì)胞大多呈現(xiàn)圓形小??點(diǎn)而黃色素細(xì)胞也能看到但呈現(xiàn)彌散狀（圖２－２，?ｅ）。在紅鯽６０ｄｐｈ時(shí)，黑色素細(xì)??胞數(shù)量出現(xiàn)了減少的趨勢(shì)，且黃色素細(xì)胞有增加的趨勢(shì)，黑色素細(xì)胞分枝態(tài)減少，??凝集態(tài)增加最后縮小直至消失（圖２－２，?ｈ）。其中觀察到含有黑色素細(xì)胞（黑箭頭）、??黃色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞，但在ＲＣ皮膚中沒有黑素細(xì)胞。通過透射電鏡觀察黑??色素細(xì)胞明顯減少

圖３－１紅鯽皮膚轉(zhuǎn)錄組拼接Ｕｎｉｇｅｎｅｓ長(zhǎng)度分布概率統(tǒng)計(jì)圖??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｔｈｅ?ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ?ｇｒａｐｈ?ｏｆ?ｕｎｉｇｅｎｅｓ?ｌｅｎｇｔｈ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓｋｉｎ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ?ｏｆ??ｒｅｄ?ｃｒｕｃｉａｎ?ｃａｒｐ??３．３．２紅鯽轉(zhuǎn)錄組組裝數(shù)據(jù)的功能注釋結(jié)果??
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本文編號(hào)：2856313