發(fā)布時(shí)間：2020-10-24 17:50

　　 長牡蠣(Crassostrea gigas),生活于潮間帶,是全世界重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類之一。由于其特殊的生態(tài)位和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,長牡蠣已成為冠輪動物中得以研究最多的物種之一。在長牡蠣中研究甲狀腺激素及其信號通路關(guān)鍵基因不僅有助于加深了解冠輪動物,也為解析無脊椎動物和脊椎動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)進(jìn)化過程、促進(jìn)牡蠣產(chǎn)業(yè)技術(shù)進(jìn)步提供寶貴的科學(xué)信息。本論文的研究內(nèi)容包括三大塊,主要內(nèi)容和結(jié)論如下:1長牡蠣甲狀腺激素及其信號通路關(guān)鍵基因的功能研究上個(gè)世紀(jì),甲狀腺激素(THs,包含T4和T3)被認(rèn)為只在脊椎動物中發(fā)揮作用。近些年,越來越多的證據(jù)表明,THs也存在于頭索和尾索動物中。然而,目前THs相關(guān)的研究在非脊索的無脊椎動物還很少見。為了研究THs的起源與進(jìn)化,我們選擇了冠輪動物的代表—牡蠣為研究對象,通過生理和分子兩種手段探討牡蠣中的THs系統(tǒng)。本研究用高效液相色譜法和液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)的方法定性的檢測了T4和T3的存在,又用電化學(xué)免疫法定量檢測了牡蠣發(fā)育過程中THs的變化。使用分子手段克隆了一些THs信號通路中的關(guān)鍵基因,包括4個(gè)合成酶甲狀腺過氧化物酶(PERT),2個(gè)代謝酶脫碘酶,一個(gè)甲狀腺激素受體(TR)。使用熒光定量分析、免疫印跡分析、亞細(xì)胞定位、原核表達(dá)、酵母雙雜交、凝膠遷移電泳(EMSA)、雙報(bào)告基因技術(shù)等一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),對這些基因進(jìn)行了功能鑒定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明,在牡蠣中也存在甲狀腺激素及其信號通路。THs可能參與胚胎形成,生長和變態(tài)等一些發(fā)育過程。牡蠣胚胎可能通過CgPERT1自體合成THs。牡蠣胚胎可以在體內(nèi)將T4轉(zhuǎn)化為T3,這項(xiàng)功能可能是由脫碘酶基因(CgDx或CgDy)行使的。CgDx和CgDy的mRNA表達(dá)受到THs和CgTR的調(diào)控,它們的啟動子區(qū)域含有TRE。THs可能通過CgTR與TRE結(jié)合來調(diào)控CgDx和CgDy的轉(zhuǎn)錄。這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)說明TH系統(tǒng)的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制在牡蠣中也是存在的。CgTR能通過與目的基因的啟動子區(qū)域結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá),并能與視黃酸X受體(CgRXR)發(fā)生相互作用。CgTR mRNA的表達(dá)受到T4和CgTR蛋白的調(diào)控,且在CgTR的啟動子區(qū)域找到了一個(gè)甲狀腺激素效應(yīng)元件(TRE)。這些CgTR的功能與脊椎動物的TR一致,說明這些功能在TR的共同祖先中已經(jīng)存在。然而,CgTR的DNA結(jié)合特性和轉(zhuǎn)錄激活活性并不保守。與血吸蟲的TR相似,CgTR能與DR0-DR5結(jié)合。此外,兩種雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明CgTR的轉(zhuǎn)錄激活活性不能被T4,T3或TRIAC激活。這些不保守的功能將為TR功能乃至TH系統(tǒng)的進(jìn)化提供寶貴的線索。這是首次在無脊椎動物中系統(tǒng)地研究THs的生理作用和分子機(jī)理。根據(jù)本研究獲得的結(jié)果,我們認(rèn)為THs及其信號通路在牡蠣中是存在的,可將THs的起源追溯至冠輪動物。2視黃酸X受體RXR的功能研究本研究克隆獲得了牡蠣中唯一的RXR基因CgRXR。該基因在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)量較高,說明可能參與到牡蠣的胚胎發(fā)育過程。該基因定位于細(xì)胞核,為其作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)提供空間便利。通過熒光雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明CgRXR的轉(zhuǎn)錄激活活性可以被9-cis RA、DHA激活,說明CgRXR LBD的結(jié)合功能是保守的。CgRXR的轉(zhuǎn)錄激活活性也可以被環(huán)境污染物三丁基錫(TBT)、三苯基錫(TPT)激活,說明有機(jī)錫污染物對牡蠣的毒害作用可能是通過RXR來介導(dǎo)的。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CgRXR能與DR0-DR5結(jié)合,除了與DR4結(jié)合較弱外,與其余的探針結(jié)合能力相當(dāng)。雙殼類RXR的DNA結(jié)合特性不保守,與脊椎動物和腹足類的均有較大差異。3新的核受體亞家族NR8的進(jìn)化分析和CgNR8A1的功能研究核受體(NR)屬于轉(zhuǎn)錄因子超級族,它通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)來調(diào)控后生動物的發(fā)育、內(nèi)穩(wěn)態(tài)、分化和繁殖等。近幾年,迅速發(fā)展的基因組計(jì)劃為核受體的進(jìn)化和功能研究提供了新的機(jī)遇。具有典型結(jié)構(gòu)的核受體被分為6個(gè)亞家族。本研究在長牡蠣中克隆了一個(gè)具有典型結(jié)構(gòu)的核受體(CgNR8A1)。然而進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該基因不能歸類于現(xiàn)有的NR亞家族。通過數(shù)據(jù)挖掘,我們在后生動物中(包括刺胞動物,軟體動物,環(huán)節(jié)動物,棘皮動物,半索動物和頭索動物)又找到了9個(gè)CgNR8A1的同源基因。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)它們組成了一個(gè)新的NR亞家族,命名為NR8亞家族。NR8是第三出現(xiàn)的NR亞家族,起源于真后生動物的共同祖先,并在脊椎動物、蛻皮動物、扁形動物的祖先中分別獨(dú)立發(fā)生了基因丟失事件。對CgNR8A1的功能研究結(jié)果表明,CgNR8A1具有核定位信號肽GKHRNKKPRLD,并定位于細(xì)胞核。發(fā)育過程中的表達(dá)模式暗示CgNR8A1可能參與胚胎的形成。EMSA實(shí)驗(yàn)顯示CgNR8A1能與保守的DNA核心基序DR0、DR2、DR4緊密結(jié)合,與DR1、DR3、DR5、Half和Pal0結(jié)合較弱。新鑒定的NR8亞家族增加了人們對NR亞家族進(jìn)化的理解,CgNR8A1的功能鑒定有助于對NR8亞家族功能的理解。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

第一章、文獻(xiàn)綜述這段短序列組成了一個(gè)非對稱的二聚接口，并且它的氨基酸序列對區(qū)分不同的DRs 有著非常重要的作用(Bourguet, Ruff et al. 1995, Knegtel, van Tilborg et al.1995)。在 DBD 和 LBD 之間的序列最初被認(rèn)為是多變的鉸鏈區(qū)。更加細(xì)致的分析該區(qū)域發(fā)現(xiàn)很多 NRs 都含有核受體定位信號肽段。該區(qū)域中與 DBD 和 LBD 銜接的末端也是高度保守的。如，N 端的 T-box 和 A-box 分別參與 NRs 的二聚化和 half-site 的識別。C 端含有的結(jié)構(gòu)域在配體介導(dǎo)的受體與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)合，特別是行駛轉(zhuǎn)錄抑制是，起關(guān)鍵作用。鉸鏈區(qū)的突變與腫瘤生成相關(guān)，說明該區(qū)域的作用曾被低估了(Bourguet, Ruff et al. 1995)。

兩條 GSP 引物進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增使用 LaTaq 反應(yīng)體系和 touchdown 反應(yīng)程序如下：touchdown 反應(yīng)程序：94°C 3 min94 °C 30 sTM+2 30 s72 °C 1kb/min94 °C 30 sTM-3 30 s72 °C 1kb/min72 °C 10 min4°C 保溫第二輪擴(kuò)增模板使用稀釋了 50 倍的第一次 PCR 產(chǎn)物，LaTaq 反應(yīng)體系和 LaTaq反應(yīng)程序。PCR 產(chǎn)物的純化，連接轉(zhuǎn)化，測序同基因片段的克隆。20 cysles10 cysles, - 0.7°C/cycle

第二章、長牡蠣甲狀腺激素及其信號通路關(guān)鍵基因的功能研究然后進(jìn)行 5’加尾反應(yīng)。以末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）為 cDNA 加尾。5’加尾反應(yīng)體系：cDNA 10 μldCTP 0.5 ul5×TdT 緩沖液 5.0 ulBSA 緩沖液 6.25 ul滅菌超純水 2.25 ul反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃冰上放置 3min，，加入 TdT 1μl，混勻 37℃水浴 15min 后，再 65℃水浴 5min，-20℃保存。以 5’加尾后的 cDNA 為模板，用 oligo(dG)-AP 和 AP 引物以及目的基因的兩條 GSP 引物進(jìn)行巢式 PCR 擴(kuò)增。第一輪和第二輪的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序及后續(xù)的操作都同 3’RACE。
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本文編號：2854795