草魚(Ctenopharyngon idellus)是亞洲國家廣泛養(yǎng)殖的重要淡水經濟魚類,是我國傳統(tǒng)的“四大家魚”之一。但草魚出血病的時常爆發(fā)給草魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。草魚呼腸孤病毒是導致草魚出血病的主要病毒性病原。在我國分離出來的數(shù)十株草魚來源呼腸孤病毒中,可分為草魚Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型呼腸孤病毒,它們的代表株分別為GCRV-873、GCRV-HZ08和GCRV-104。蛋白酶體是細胞內負責降解細胞內錯誤折疊、異常累積、衰老損傷等蛋白質的主要細胞器之一,是非溶酶體-泛素依賴型蛋白降解過程中的核心蛋白酶,參與了細胞內蛋白質控,抗原處理,信號轉導,細胞周期調控,細胞分化以及細胞凋亡等多種過程。本研究利用酵母雙雜交技術發(fā)現(xiàn)了草魚PSMB7蛋白與草魚Ⅲ型呼腸孤病毒外衣殼蛋白VP38之間存在潛在的相互作用,并利用多種現(xiàn)代分子生物學技術驗證了草魚三種基因型呼腸孤病毒外衣殼蛋白VP7,VP35,VP38與PSMB7之間的相互作用。具體研究內容如下:1.利用酵母雙雜交技術篩選與草魚Ⅲ型呼腸孤病毒VP6和VP38相互作用的宿主蛋白利用酵母雙雜交篩選了能與GCRV104 VP6和VP38相互作用的宿主蛋白。利用RT-PCR擴增GCRV104 s8和s10基因組片段,構建誘餌質粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38;對重組質粒進行細胞毒性和自激活檢測,分別以VP6和VP38為誘餌在草魚酵母文庫中篩選與其相互作用的宿主蛋白,對篩選得到的陽性酵母菌落進行測序分析。結果表明,兩個誘餌質粒pGBKT7-VP6和pGBKT7-VP38均無自激活作用;誘餌質粒pGBKT7-VP6篩選到7株陽性克隆,分別編碼β肌動蛋白、augmin樣復合體亞基2、甘露糖苷酶α2b1亞基、程序性細胞死亡蛋白6、真核翻譯延長因子1γ和一個未知功能蛋白;誘餌質粒pGBKT7-VP38篩選到4株陽性克隆,分別編碼剪切與多聚腺苷酸化特異性因子5、高遷移率組蛋白核小體結合結構域2、葡萄糖轉運體X和蛋白酶體亞基β7。2.GCRV-104 VP38與PSMB7的表達分析以及多克隆抗體制備為進一步研究VP38的生物學功能,及為后續(xù)實驗準備良好的實驗材料,實驗構建了VP38蛋白的原核表達質粒pET28a-VP38,轉化至大腸桿菌感受態(tài)BL21中,經IPTG誘導表達之后純化蛋白,免疫小鼠,制備多克隆抗;利用Western blot及IFA對所得鼠抗VP38多克隆抗體進行評估,同時利用該多克隆抗體對GCRV-104感染CIK細胞后不同時間點VP38的表達特性進行分析。結果顯示本實驗制備的多克隆抗體能夠特異性地識別原核表達的重組蛋白及GCRV-104感染細胞樣品中的VP38蛋白;VP38蛋白在感染72 h后主要分布在宿主細胞的細胞質中,呈均質分布;VP38在GCRV104感染前期微量表達,中后期大量表達。為進一步驗證PSMB7與VP38的相互作用,探究PSMB7在病毒感染過程中的表達特性以及具體功能,我們根據(jù)草魚轉錄組數(shù)據(jù)庫信息,利用RT-PCR擴增了PSMB7的全長ORF,同時對PSMB7的基因序列及氨基酸序列進行了分析,構建了PSMB7的原核表達質粒pET28a-PSMB7及真核表達質粒pEGFP-N1-PSMB7;pET28a-PSMB7轉化至BL21感受態(tài)細胞后,利用IPTG誘導蛋白表達,將純化后的蛋白免疫小鼠,獲得鼠源多克隆抗體;利用Western blot對制備的多克隆抗體進行分析;pEGFP-N1-PSMB7轉染至GCO細胞后進行亞細胞定位分析;結果表明,草魚psmb7基因全長834bp,編碼277個氨基酸,具有保守性酶活位點,為Ntn-水解酶超家族成員;PSMB7在GCO細胞中主要分布在核周區(qū)域;實驗制備的PSMB7多克隆抗體能夠特異性識別草魚CIK細胞及GCO細胞的內源PSMB7蛋白,該多抗具有較高的效價和較好的特異性。3.草魚三種基因型呼腸孤病毒外衣殼蛋白與蛋白酶體亞基β7(PSMB7)的相互作用本章節(jié)利用定向酵母雙雜交技術、Far western blot、His Pull-Down、細胞內共定位、Co-IP等技術驗證了VP38與PSMB7之間的相互作用;并利用酵母雙雜交、Co-IP驗證了PSMB7同時也能夠與草魚Ⅰ型和Ⅱ型呼腸孤病毒的外衣殼蛋白VP7和VP35相互作用;對PSMB7進行截斷,利用酵母雙雜交實驗探究了不同截斷與VP38的相互作用;利用制備的多克隆抗體及realtime RT-PCR對病毒感染后PSMB7在翻譯及轉錄水平上的表達量變化進行了監(jiān)測。結果顯示PSMB7與草魚三種基因型呼腸孤病毒的外衣殼蛋白均發(fā)生相互作用;VP38與PSMB7之間為多位點相互作用;GCRV-JX01及GCRV104感染后PSMB7在轉錄水平下調,而在翻譯水平無明顯變化。本研究利用酵母雙雜交技術篩選了與GCRV-104編碼的VP6和VP38蛋白存在潛在相互作用的宿主蛋白,對VP38和PSMB7進行了表達、分析及多克隆抗體的制備,利用多種實驗技術驗證了PSMB7與草魚三種呼腸孤病毒外衣殼蛋白的相互作用,探究了PSMB7在病毒感染后在轉錄及翻譯水平的表達量變化,為進一步了解GCRV的感染機制提供了一定的理論基礎。
【學位單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S943
【部分圖文】：

圖 2-1 s8 和 s10 RT-PCR 擴增結果M：DL2000 標尺；NC：陰性對照 Amplification result of GCRV-104 s8 and s10 bM:DL2000 Marker；NC:Negative Control激活檢測DT7 質粒的酵母 AH109 在 SD/-Trp 平GBKT7-VP6/pGADT7 與 pGBKT7-VPu 平板上均生長良好（圖 2-2）；分別 與 pGBKT7-VP38/pGADT7 的酵母 AH。該結果表明：VP6 蛋白和 VP38 蛋白對

圖 2-2 pGBKT7-VP6 與 pGBKT7-VP38 的自激活檢測化質粒 pGBKT7-VP6/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板的粒 pGBKT7-VP6/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu-His 平板質粒 pGBKT7-VP38/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板質粒 pGBKT7-VP38/pGADT7 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu-His 平Fig.2-2 Self-activation detection of pGBKT7-VP6 and pGBKT7-VP38109 transformants with pGBKT7-VP6/pGADT7 grown on SD/-Trp-Leu09 transformants with pGBKT7-VP6/pGADT7 did not grow on SD/-Trplates;09 transformants with pGBKT7-VP38/pGADT7 grown on SD/-Trp-Le09 transformants with pGBKT7-VP38/pGADT7 did not grow on SD/-Tplates

圖 2-3 SD/-Trp-Leu 平板篩選的陽性菌落A：攜帶有文庫質粒與 pGBKT7-VP6 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板上生長(代表平板)；B：攜帶有文庫質粒與 pGBKT7-VP38 的酵母 AH109 在 SD/-Trp-Leu 平板上生長(代表平板Fig.2-3 Positive clones screened by SD/-Trp-Leu selection platesA ：AH109 transformants with pGBKT7-VP6/ library plasmid grown on SD/-Trp-Leu plates(representative plate)；B：AH109 transformants with pGBKT7-VP38/ library plasmid grown on SD/-Trp-Leu plates(representative plate)AB
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 戈賢平;繆凌鴻;;我國大宗淡水魚產業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與體系研究進展[J];中國漁業(yè)質量與標準;2011年03期

2 陳燕燊,江育林;草魚出血病病毒形態(tài)結構及其理化特性的研究[J];科學通報;1983年18期

本文編號：2851105