多倍體化是物種進(jìn)化的重要特征。遠(yuǎn)緣雜交是將一個(gè)物種的基因組轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種中的有效方法,從而使得雜交后代在表型上顯示出雜種優(yōu)勢(shì)以及在基因型上形成多倍體。在紅鯽(Carassius,auratus red var.,RCC,♀)和鯉魚(Cyprinuscarpio,CC,3)之間遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的F2代中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了不減數(shù)的二倍體配子,運(yùn)用人工方法將F2代進(jìn)行自交得到了異源四倍體鯽鯉(4nAT),目前已獲得遺傳穩(wěn)定的兩性可育的異源四倍體魚品系(F3-F27)。本實(shí)驗(yàn)室通過改良紅鯽和改良異源四倍體鯽鯉進(jìn)行雜交得到了不育三倍體湘云鯽2號(hào)。三倍體魚的精巢正常發(fā)育但是卻沒有正常的精子產(chǎn)生,由于三倍體魚的性腺敗育,具有在任何水域進(jìn)行養(yǎng)殖都不會(huì)對(duì)自然界中的種質(zhì)資源造成影響的特點(diǎn)而在中國(guó)被廣泛養(yǎng)殖。Dnah3與精子的鞭毛組裝、鞭毛的運(yùn)動(dòng)以及精子的活動(dòng)有關(guān)。Ift57對(duì)維持鞭毛的長(zhǎng)度和雙向物質(zhì)運(yùn)輸是不可或缺的,這兩個(gè)基因的異常突變都會(huì)導(dǎo)致精子鞭毛發(fā)生異常,進(jìn)而無法產(chǎn)生正常精子而敗育。本小組在前期的研究中已成功構(gòu)建了不同倍性鯽鯉精巢中的miRNAs文庫(kù),通過對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),我們發(fā)現(xiàn)Dnah3和Ift57分別是miR-199-5p和miR-221的靶基因,在本研究中對(duì)Dnah3基因和If57基因的部分cDNA序列進(jìn)行了克隆,并對(duì)這兩個(gè)基因在不同倍性鯽鯉組織中進(jìn)行了半定量表達(dá)分析以及在精巢組織中進(jìn)行了定量研究分析。microRNAs(miRNAs)是真核生物內(nèi)一類基因長(zhǎng)度大約為17-24nt內(nèi)源性的非編碼小分子RNA。miRNAs通過與其靶基因mRNA的3'UTR區(qū)完全或是不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。越來越多的研究表明,miRNA與器官的形成、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生以及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等均有密切的關(guān)系。在本文中,我們構(gòu)建了紅鯽和異源四倍體鯽鯉卵巢的miRNAs文庫(kù),且在多個(gè)方面對(duì)文庫(kù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析并通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)所得測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。1.克隆并分析了Dnah3基因在二倍體紅鯽、異源三倍體鯽和異源四倍體鯽鯉中的部分cDNA序列,并對(duì)其進(jìn)行了不同倍性鯽鯉9種組織中的差異性表達(dá)分析和研究,結(jié)果表明在精巢中的表達(dá)量高于其他組織。通過qPCR研究基因在不同倍性鯽鯉精巢中的表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示在不育三倍體魚中的表達(dá)量比在可育二倍體魚和四倍體魚中低。2.克隆并分析了If57基因在二倍體紅鯽、異源三倍體鯽和異源四倍體鯽鯉中的部分cDNA序列,并對(duì)其進(jìn)行了不同倍性鯽鯉9種組織中的差異性表達(dá)分析和研究,結(jié)果表明在精巢中的表達(dá)量高于其他組織。通過qPCR研究基因在不同倍性鯽鯉精巢中的表達(dá),qPCR結(jié)果顯示不育三倍體魚中的表達(dá)量比在可育的二倍體魚和四倍體魚中低。3.分別取紅鯽和異源四倍體鯽鯉各三條卵巢組織樣本,提取RNA后進(jìn)行高通量測(cè)序,對(duì)數(shù)據(jù)篩選后得到的clean reads分別為:1,252,130條(HJ1♀)、13,885,093條(HJ2♀f)、10,318,700條(HJ♀f)、12,888,037條(4nl♀f)、13,012,243條(4n2♀f)、11,342,865條(4n早f)。利用MIRDeep2軟件將miRNA序列mapped到參考基因組上,結(jié)果顯示,在二倍體紅鯽中有441條成熟的miRNAs序列;在異源四倍體鯽鯉中共有418條miRNAs序列。經(jīng)Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)分析發(fā)現(xiàn),相對(duì)二倍體在4nAT中有9條保守miRNAs表達(dá)下調(diào),30條保守miRNAs和4條非保守miRNAs是表達(dá)上調(diào)。基于高通量測(cè)序的結(jié)果,我們選取了五個(gè)在不同倍性魚類卵巢中差異表達(dá)的miRNAs(miR-6843-3p,miR-8lb-p,miR-42-5p,miR-21-5p,and miR-2368-3p),通過qRT-PCR驗(yàn)證其相對(duì)表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果與高通量測(cè)序的結(jié)果一致。然后我們將具有明顯表達(dá)差異的miRNA在miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目標(biāo)基因序列進(jìn)行預(yù)測(cè),與NR、Swiss-Prot、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)后,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行功能注釋和分類。
【學(xué)位單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

選擇及其影響因素還不是很確定，推測(cè)這可能由特定的ｍｉＲＮＡ和靶基因，或是??特定的組織和細(xì)胞來決定，也可能受控于不同的信號(hào)通路。下圖為ｍｉＲＮＡ的兩??種作用于靶ＲＮＡ的方式（圖１－１）?［５４】。??７??

環(huán)閾值（ＣＴ）并進(jìn)行繪圖表達(dá)。??２．２．５．３實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析??用ｑＰＣＲ的實(shí)驗(yàn)方法，運(yùn)用２－ＡＡＣ：ｔ方法計(jì)算并作圖得到如圖２－１的表達(dá)量圖??譜。??１０????８?－??５Ｃｌ—?Ｉ??ｔｅｓｔｉｓ－ｄｎａｆ＞３??■■■■■?２ｎ?＿Ｘ?Ｄａｔａ??Ｉ?ｔ?３ｒｉ??此■滅４ｎ??圖２－ｌ?基因在不同倍性鯽鯉中的表達(dá)量??Ｆｉｇ．２－ｌ?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?Ｄｎａｈ３?ｇｅｎｅ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｐｌｏｉｄｙ?Ｃｙｐｒｉｎｉｄｓ??注：２ｎ：二倍體紅鯽（ＲＣＣ）?；?３ｎ：異源三倍體鯽魚；４ｎ：異源四倍體鯽鯉（４ｎＡＴ）??用不同倍性鯽鯉的精巢組織進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，??在異源三倍體鯽鯉中基因的表達(dá)量相對(duì)于二倍體紅鯽和異源四倍體鯽鯉??中的表達(dá)量下調(diào)。??２．２．６Ｚ）；７ｆｌＡ３基因在不同組織部位的表達(dá)??在克隆獲得基因的部分序列后，提取不同倍性鯽鯉的腦、心臟、腎臟、??肝臟、肌肉、卵巢、垂體、脾臟、精巢這９個(gè)組織的總ＲＮＡ，實(shí)驗(yàn)步驟見２．２．１。??然后將其分別反轉(zhuǎn)錄為ｃＤＮＡ，實(shí)驗(yàn)方法見２．２．２。用半定量ＲＴ－ＰＣＲ的實(shí)驗(yàn)方法研??宄該基因在紅鯽，異源三倍體鯽魚以及在異源四倍體鯽鯉的９種不同組織中的表??達(dá)，反應(yīng)體系如下表（表２－８）。??１８??

加
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 張純;劉少軍;孫遠(yuǎn)東;肖俊;覃欽博;王靜;何偉國(guó);尤翠平;劉筠;;遠(yuǎn)緣雜交形成的二倍體魚和多倍體魚生殖細(xì)胞染色體研究[J];分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào);2008年01期

2 張?bào)闾m,姜明,姚斐,叢嬌日,郭恩棉,高瀾,范瑞青,姚善成;紅鰭東方鲀精子形態(tài)的研究[J];青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1999年02期

3 尤永隆，林丹軍;鯉魚精子超微結(jié)構(gòu)的研究[J];動(dòng)物學(xué)研究;1996年04期

4 方展強(qiáng);尼羅羅非魚精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究[J];華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1993年01期

5 張旭晨,王所安;細(xì)鱗魚精巢超微結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);1992年04期

6 管汀鷺;黃丹青;黃國(guó)屏;;金魚精巢的細(xì)胞構(gòu)造與精子的發(fā)生和形成[J];水生生物學(xué)報(bào);1990年03期

7 林光華,翁世(馬總),張豐旺;繁殖季節(jié)荷包紅鯉性腺發(fā)育的研究[J];南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版);1982年03期

8 張中英,仇潛如,胡玫,林克宏;鳙♀×(鳙♀×鰱♂)♂回交魚胚胎、幼魚發(fā)育研究[J];動(dòng)物學(xué)報(bào);1979年02期

9 張建森,馬仲波,王楚松;元江鯉♀與柏氏鯉■雜交一代(柏元鯉)的研究和利用[J];淡水漁業(yè);1979年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 郭將;雞TLR7靶向miRNA的預(yù)測(cè)及鑒定[D];吉林大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2847235