可變剪接普遍存在于真核生物中,是基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié),通過(guò)外顯子的不同組合可產(chǎn)生一系列差異轉(zhuǎn)錄本,在極大程度上豐富了生物體的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組多樣性。同時(shí),異常的可變剪接也將直接導(dǎo)致機(jī)體生理功能的紊亂。因此,可變剪接事件對(duì)于生物體正常生理功能的實(shí)現(xiàn)是至關(guān)重要的。唐氏綜合征細(xì)胞黏附分子(Dscam)是可變剪接的代表性基因,在果蠅(D.melanogaster)中可潛在產(chǎn)生38,016種可變剪接異構(gòu)體,且該基因的可變剪接現(xiàn)象僅在節(jié)肢動(dòng)物中發(fā)生。令人振奮的是,節(jié)肢動(dòng)物Dscam基因的大量異構(gòu)體被證明具有免疫特異性,并有學(xué)者據(jù)此推測(cè)該基因可能與免疫致敏(immune priming)或免疫訓(xùn)練(trained immunity)現(xiàn)象有關(guān)。為明確Dscam對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞蛋白表達(dá)的調(diào)控,本論文基于同位素標(biāo)記的iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)Dscam敲降并金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激的原代培養(yǎng)血細(xì)胞分泌蛋白進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明諸多細(xì)胞生理功能相關(guān)蛋白受到了Dscam的影響,特別是抗菌肽等免疫效應(yīng)因子的表達(dá)受到了Dscam的極顯著正調(diào)控。proPO等免疫因子在Dscam敲降后呈現(xiàn)顯著上調(diào)的表達(dá),說(shuō)明宿主可能通過(guò)補(bǔ)償機(jī)制彌補(bǔ)抗菌肽表達(dá)的下降。此外,剪接體等細(xì)胞內(nèi)蛋白也在細(xì)胞培養(yǎng)液中被檢測(cè)到顯著變化,這可能與細(xì)菌導(dǎo)致血細(xì)胞破裂從而釋放內(nèi)容物有關(guān)。這些結(jié)果暗示作為跨膜型蛋白,Dscam的細(xì)胞外部分在接收細(xì)菌的危險(xiǎn)訊息后,極可能將信號(hào)傳遞入細(xì)胞內(nèi),通過(guò)細(xì)胞內(nèi)區(qū)域激活相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,產(chǎn)生抗菌肽等免疫效應(yīng)因子,完成免疫防御過(guò)程。因此,本論文將聚焦中華絨螯蟹跨膜型Dscam的可變剪接機(jī)制及其細(xì)胞質(zhì)尾可變剪接異構(gòu)體調(diào)控抗菌肽表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。既往研究報(bào)道,RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和剪接因子可能是介導(dǎo)Dscam可變剪接的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此,我們首先基于果蠅的Dscam RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)特征序列在中華絨螯蟹Dscam基因全長(zhǎng)中進(jìn)行了比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子對(duì)接位點(diǎn)(docking site)、選擇子序列(selector sequence)和基因座控制區(qū)(locus control region)的協(xié)同作用是導(dǎo)致Dscam基因pre-mRNA進(jìn)行剪接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。進(jìn)一步的研究在中華絨螯蟹中分離并鑒定了B52基因(EsB52)。Es B52序列包括一個(gè)5’端非編碼區(qū)(UTR),一個(gè)876-bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼291個(gè)氨基酸殘基,一個(gè)3’端非編碼區(qū)。EsB52編碼的氨基酸序列全長(zhǎng)包括兩個(gè)RNA識(shí)別基序(RNA recognition motifs,RRM),分別位于N端的5-70,103-171氨基酸殘基。C端富含精氨酸和絲氨酸。每個(gè)RRM基序都包含兩個(gè)短序列RNP-1和RNP2。組織表達(dá)分析顯示,Es B52 mRNA在所有檢測(cè)組織中均有廣泛表達(dá),尤其是在腦和血細(xì)胞中表達(dá)較高。在血細(xì)胞中,Es B52在與病原體相關(guān)的分子模式和細(xì)菌刺激后顯著上調(diào)。此外,Es B52 RNAi降低了mRNA中Ig7亞型的數(shù)量,而對(duì)于Ig2或Ig3沒(méi)有影響。上述研究表明,分子對(duì)接位點(diǎn)、選擇子序列、基因座控制區(qū)是中華絨螯蟹Dscam可變剪接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而B52等剪接因子是激活Dscam可變剪接的重要調(diào)控元件之一。Dscam蛋白廣泛存在于節(jié)肢動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中,并且其與病原體特異性結(jié)合和吞噬細(xì)菌的能力已經(jīng)被證實(shí)。然而,Dscam識(shí)別并結(jié)合病原后如何激活免疫相關(guān)的信號(hào)通路機(jī)制尚不清楚�；谖覀儗�(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果,已經(jīng)確認(rèn)了中華絨螯蟹中跨膜型Dscam細(xì)胞質(zhì)尾中的可變剪接外顯子以及細(xì)胞質(zhì)尾在血細(xì)胞中存在的亞型,并且在革蘭氏陽(yáng)性菌刺激下體外沉默跨膜型Es Dscam會(huì)導(dǎo)致抗菌肽表達(dá)量下調(diào)。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)EsDscam細(xì)胞質(zhì)尾非可變剪接32號(hào)外顯子的翻譯蛋白編碼SH3結(jié)合基序,并因此與Dock蛋白的SH3結(jié)合基序相互作用。Dock蛋白具有類似EsDscam調(diào)控ERK磷酸化、Dorsal核轉(zhuǎn)運(yùn)、抗菌肽表達(dá)等功能。進(jìn)一步通過(guò)RNAi、Co-IP等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)Dock蛋白通過(guò)非直接結(jié)合調(diào)控ERK磷酸化。同時(shí)本研究也證實(shí)可變剪接外顯子不具備調(diào)控ERK磷酸化、Dorsal核轉(zhuǎn)運(yùn)和抗菌肽表達(dá)的能力。上述研究表明,EsDscam細(xì)胞質(zhì)尾區(qū)域通過(guò)非可變剪接外顯子的翻譯蛋白結(jié)合Dock蛋白,調(diào)控ERK磷酸化,促進(jìn)Toll信號(hào)通路關(guān)鍵分子Dorsal從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)而上調(diào)抗菌肽表達(dá),完成抗菌免疫防御過(guò)程。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    第一節(jié) 無(wú)脊椎動(dòng)物Dscam基因的研究進(jìn)展
        1.1 引言
        1.2 Dscam基因的發(fā)現(xiàn)
        1.3 Dscam基因的高度可變性
    第二節(jié) 節(jié)肢動(dòng)物Dscam基因的免疫功能
        2.1 引言
        2.2 Dscam對(duì)不同PAMPs和細(xì)菌的免疫應(yīng)答
        2.3 Dscam對(duì)寄生蟲和病毒的免疫應(yīng)答
    第三節(jié) 研究意義及實(shí)驗(yàn)方案
        3.1 研究意義
        3.2 研究方案
第二章 基于iTRAQ技術(shù)篩選中華絨螯蟹Dscam基因調(diào)控的蛋白表達(dá)
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 EsDscam的體外干擾實(shí)驗(yàn)
        2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
        2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫刺激
        2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        2.6 iTRAQ原理
        2.7 iTRAQ實(shí)驗(yàn)流程
        2.8 iTRAQ實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析流程
        2.9 質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)處理分析
        2.10 蛋白質(zhì)定性和定量分析參數(shù)
        2.11 Gene Ontology(GO)功能注釋
    第三節(jié) 結(jié)果
        3.1 Es Dscam的體外沉默分析
        3.2 蛋白質(zhì)豐度比分布圖
        3.3 蛋白質(zhì)鑒定及注釋
        3.4 差異豐度蛋白的鑒定及定量分析
        3.5 蛋白質(zhì)樣品的基因本體(Gene ontology,GO)分析
    第四節(jié) 討論
第三章 B52 調(diào)控Dscam可變剪接
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 序列比對(duì)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        2.3 樣品采集及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫刺激
        2.4 總RNA提取和第一鏈c DNA合成
        2.5 全長(zhǎng)Es B52 cDNA的克隆
        2.6 全長(zhǎng)Es B52 cDNA的生物信息學(xué)分析
        2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
        2.8 EsB52的體外干擾實(shí)驗(yàn)
        2.9 在Es B52 沉默模板中擴(kuò)增Es Dscam細(xì)胞外高變區(qū)
        2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    第三節(jié) 結(jié)果
        3.1 Es Dscam-hv的 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)
        3.2 Es B52 基因的序列分析
        3.3 Es B52 的組織表達(dá)分析
        3.4 血細(xì)胞免疫刺激后Es B52 的表達(dá)模式分析
        3.5 Es B52 的體外沉默分析
        3.6 Es B52的體外沉默對(duì)Es Dscam細(xì)胞外高變異區(qū)域的影響
    第四節(jié) 討論
第四章 Dock基因的免疫功能研究
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 樣品采集及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫刺激
        2.3 總RNA提取和第一鏈c DNA合成
        2.4 Es Dock cDNA的克隆
        2.5 Es Dock cDNA的生物信息學(xué)分析
        2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
        2.7 EsDock的體外干擾實(shí)驗(yàn)
        2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        2.9 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        2.10 Western Blot檢測(cè)
    第三節(jié) 結(jié)果
        3.1 Es Dock基因的序列分析
        3.2 金黃色葡萄球菌刺激血細(xì)胞后Es Dock的表達(dá)
        3.3 Es Dock的體外沉默分析
        3.4 Es Dock的體外沉默對(duì)抗菌肽表達(dá)的影響
        3.5 金黃色葡萄球菌刺激下Es Dock能夠誘導(dǎo)ERK信號(hào)分子激活
        3.6 金黃色葡萄球菌刺激下Es Dock調(diào)控Toll信號(hào)通路
    第四節(jié) 討論
第五章 Dscam細(xì)胞質(zhì)尾調(diào)控抗菌肽表達(dá)的分子機(jī)制
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 樣品采集及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫刺激
        2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
        2.4 Exon33、Exon35 的體外干擾實(shí)驗(yàn)
        2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        2.6 免疫熒光試驗(yàn)
        2.7 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
        2.8 免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)
        2.9 Western Blot檢測(cè)
    第三節(jié) 結(jié)果
        3.1 跨膜型Dscam細(xì)胞質(zhì)尾可變剪接外顯子體外沉默
        3.2 Exon33和Exon35 的體外沉默對(duì)抗菌肽表達(dá)的影響
        3.3 金黃色葡萄球菌刺激下Exon33和Exon35對(duì)ERK信號(hào)分子磷酸化的影響
        3.4 金黃色葡萄球菌刺激下Exon33和Exon35對(duì)Toll信號(hào)通路的影響
        3.5 跨膜型Es Dscam細(xì)胞質(zhì)尾與Es Dock的結(jié)合
        3.6 Es Dock與 ERK分子的相互作用
    第四節(jié) 討論
本研究的結(jié)論、特色與創(chuàng)新點(diǎn)、展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

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