C型凝集素是一類含有糖識別結構域(Carbonhydrate recognition domain,CRD)的超家族,是固有免疫系統(tǒng)中的重要模式識別受體(Pattern-recognition receptor,PRR)。本研究以棘皮動物仿刺參(Apostichopus japonicus)為材料,綜合利用生物信息學、分子生物學和免疫學等技術開展了對含單個CRD的C型凝集素(SJL-1)和含有多個功能結構域的C型凝集素(AjCTL-2)的分子克隆、蛋白表達及免疫學功能研究,并結合各自的結構特征探討其糖識別機制,闡釋了仿刺參C型凝集素在免疫防御中的作用。本論文對含DPN/WVD基序的單CRD結構域的C型凝集素SJL-1進行了免疫識別和結合活的性研究。發(fā)現(xiàn)SJL-1在仿刺參的管足、體壁和呼吸樹等水管系統(tǒng)中特異性分布。同時,體腔細胞中的SJL-1能夠響應燦爛弧菌刺激,在12小時時其mRNA表達水平顯著上調。體外重組SJL-1蛋白(rSJL-1)能結合LPS、PGN、Mannose和D-galactose,具有廣譜的病原體相關分子模式(PAMPs)結合活性。此外,rSJL-1能結合耶羅維亞酵母、畢赤酵母、金黃色葡萄球菌、短雙歧桿菌、鰻弧菌和燦爛弧菌,且SJL-1的所有體外結合活性均需要Ca~(2+)的參與。以上結果表明SJL-1能夠作為模式識別受體,含有單一的CRD結構域,具有廣譜依賴Ca~(2+)的PAMPs和微生物識別活性。為了進一步了解仿刺參C型凝集素的結構與功能特征關系。本論文對含三個不同的功能結構域的AjCTL-2進行了免疫功能研究。AjCTL-2的三個功能結構分別為low density lipoprotein receptor class A(LDLa)、C1r/C1s/Uegf/bone morphogenetic protein 1(CUB)和一個CRD。位于Ca~(2+)結合位點2的關鍵氨基酸基序為EPN/WND。mRNA水平檢測到該蛋白在仿刺參的體腔細胞中高表達。在仿刺參受到燦爛弧菌刺激后,體腔細胞中AjCTL-2的mRNA表達水平在12小時時顯著上升。我們還檢測到AjCTL-2的重組蛋白(rAjCTL-2)能夠在體外不依賴Ca~(2+)結合D-galactose,但是rAjCTL-2對LPS、PGN和Mannose的結合活性卻未檢測到。除此之外,r AjCTL-2能結合短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、燦爛弧菌(Vibrio splendidus)、鰻弧菌(Vibrio auguillarum)和耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica),且rAjCTL-2的體外菌結合能力不依賴Ca~(2+)。本論文研究的兩種不同的仿刺參C型凝集素均能作為模式識別蛋白識別并結合PAMPs及微生物,在仿刺參免疫防御過程中發(fā)揮重要作用。研究成果豐富了解棘皮動物免疫識別分子的結構與功能,為闡明棘皮動物的免疫防御機制奠定了基礎。
【學位單位】：大連海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

2圖 1-1 脊椎動物 C 型凝集素分類[2]Fig 1-1 Classification of C-type lectin in vertebrates集素的結構與功能集素的結構為止，C 型凝集素的判斷標準是是否含有 CRD 結構域，已有的蛋白晶體表明，CRD 由 120 個左右的氨基酸殘基構成，是具有雙環(huán)結構的結構域由兩個位于側翼的 α-螺旋和若干位于結構內部反向平行的 β-折疊組成結構由四個非常保守的半胱氨酸殘基（C1-C4）成型的二硫鍵連接，其著整個環(huán)狀結構，而 C2 和 C3 則連接由反向平行的 β-折疊構成的“長”結構是 CRD 與 Ca2+及糖類結合的關鍵部位[11]。部分的 CRD 含有一 β-發(fā)夾結構，由一對半胱氨酸殘基（C0，C0’）形成的二硫鍵將其固定

圖 1-2 CRD 高級結構圖[2]Fig 1-2 Tertiary structure of CRD過對多個 C 型凝集素的結構解析發(fā)現(xiàn) CRD 一般含有 4 個位點的位置不僅取決于 CRD 的氨基酸序列，同時也與Ca2+結合位點 1，2 和 3 通常位于 CRD 的 β-發(fā)夾結構附間的鹽橋有關[13]。在這 4 個 Ca2+結合位點中，Ca2+糖類的關鍵位點。C 型凝集素的糖識別活性和結合特異質子受體的位置來決定的[14]。與 Ca2+結合的氨基酸通形成復合體，這些氨基酸殘基形成了兩組關鍵的氨基酸酸基序是“EPN”（谷氨酸-脯氨酸-天冬氨酸）或“QPD”（。蛋白晶體結構學研究表明：關鍵氨基酸基序由“EPN”點 2 的結構發(fā)生重大變化，而是與糖結合平面上質子互換，進而使氫鍵結合的方向由 mannose-型轉換為 gala凝集素素的突變體結合特異性研究，生物學家發(fā)現(xiàn)：在

Ca2+與糖的氨基酸側鏈形成配位鍵；綠色虛線箭頭代表氫鍵；箭頭的方向供體到質子受體的方向圖 1-3 CRD 的 Ca2+結合位點 2 與 Mannose 的結合圖[14]Fig 1-3 Ca2+binding site 2 of CRD bind to Mannose的功能 世紀末科學家就提出了模式識別的理論，即盡管病原微生物的它們都編碼一類結構高度保守且種類有限的病原相關模associated molecular patterns, PAMPs）[18, 19]。 PAMPs 存在于病原內部以維持微生物的生長和繁殖[19]。宿主通過編碼合成不同的）來識別不同的 PAMPs，這種識別作用被稱為模式識別[10]。 C R 家族的成員，能夠通過識別微生物表面多種 PAMPs 進而結合Dectin-1 能夠特異性識別真菌表面的葡聚糖，是機體抗真菌感染
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本文編號：2838323