發(fā)布時間：2020-10-08 18:00

　　 線粒體ATP合酶產(chǎn)生的ATP是細(xì)胞絕大多數(shù)生命活動的能量來源,對真核生物的生存至關(guān)重要�？墒墙刂沟侥壳�,ATP合酶在日本囊對蝦先天免疫中的作用還不明朗。本論文主要研究線粒體ATP合酶相關(guān)的四種smORF-s在日本囊對蝦病毒免疫反應(yīng)中的功能。日本囊對蝦ATP合酶抑制因子1被WSSV利用以幫助其復(fù)制MjATPIF1是一種天然的ATP合酶抑制蛋白。它可以通過調(diào)節(jié)ATP合酶的活性來改變細(xì)胞的生理狀態(tài)。然而截止到目前,MjATPIF1在對蝦免疫方面發(fā)揮的功能尚未被確定。在本研究中,我們從日本囊對蝦中篩選到一種小開放閱讀框為ATP合酶抑制因子1,并命名為對蝦ATP合酶抑制因子1(MjATPIF1),其開放閱讀框包含315個核苷酸,編碼104個氨基酸。MjATPIF1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均廣泛分布于日本囊對蝦的多種免疫相關(guān)組織中。表達(dá)模式闡明病毒刺激后MjATPIF1在血細(xì)胞和腸中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨向。過表達(dá)(重組蛋白注射)以及RNA干擾實驗表明MjATPIF1有利于白斑綜合征病毒在日本囊對蝦體內(nèi)拷貝數(shù)的增加。線粒體超氧化物檢測表明,MjATPIF1可以促進(jìn)線粒體超氧化物(SOD)的產(chǎn)生。免疫細(xì)胞化學(xué)實驗結(jié)果顯示,MjATPIF1能夠通過產(chǎn)生SOD提高NF-κB活性進(jìn)而增進(jìn)白斑綜合征病毒拷貝數(shù)的增加。而ATP檢測結(jié)果表明,MjATPIF1通過改變細(xì)胞呼吸類型促進(jìn)病毒復(fù)制和翻譯。所有實驗結(jié)果均表明,MjATPIF1在對蝦體內(nèi)被WSSV利用而有利于病毒復(fù)制。因此,WSSV能挾持對蝦的ATP合酶抑制因子1增進(jìn)其在對蝦體內(nèi)拷貝數(shù)的增加。日本囊對蝦三種ATP合酶亞基有利于WSSV復(fù)制我們在日本囊對蝦的轉(zhuǎn)錄組中篩選到三個小開放閱讀框,分別命名為ATP合酶亞基E(MjATP5I)、ATP合酶亞基G(MjATP5L)以及ATP合酶亞基ε(MjATP5E),它們都是F1Fo-ATP合酶的亞基,與其他的ATP合酶亞基共同組成F1F0-ATP合酶。ATP合酶在氧化磷酸化途徑中合成ATP的動力來源是質(zhì)子梯度勢�？墒顷P(guān)于這三種ATP合酶亞基在免疫方面的功能還不是很清楚。我們分析了三個ATP合酶亞基MjATP5I,MjATP5L和MjATP5E在日本囊對蝦病毒免疫反應(yīng)中的功能。完整的MjATP5I開放閱讀框序列一共有258個堿基對,編碼85個氨基酸;;MjATP5L的序列全長為300個堿基對,編碼99個氨基酸;MjATP5E的開放閱讀框含1168對堿基,編碼55個氨基酸。在轉(zhuǎn)錄水平上,這三個ATP合酶亞基廣泛分布于多個免疫組織中。而WSSV刺激的表達(dá)模式檢測指出,MjATP5I、MjATP5L和MjATP5E在血細(xì)胞和腸中均表現(xiàn)上調(diào)趨向。而過表達(dá)(注射重組蛋白)實驗和RNA干擾實驗指出,MjATP5I、MjATP5L和MjATP5E都有利于白斑綜合征病毒在日本囊對蝦體內(nèi)拷貝數(shù)的增加。這些實驗結(jié)果表明,MjATP5I、MjATP5L和MjATP5E在對蝦中可促進(jìn)WSSV復(fù)制,而其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S945.4
【部分圖文】：

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文逡逑圖２．１．邋Ａ＾／ＡＴＰＩＦｌ的序列分析。Ａ．邋ＭｙＡＴＰＩＦｌ的核酸序列和氨基酸序列。下劃線處是ＭｙＡＴＰＩＦｌ逡逑的最小抑制序列。同時也是＾＾／義�。浚�？１１１１１１被突變掉的區(qū)域。Ｂ．ＭｙＡＴＰＩＦｌ的結(jié)構(gòu)域分析。Ｃ．逡逑不同物種之間ＡＴＰＩＦ１的序列分析。其中包括人、小鼠、南美白對蝦和日本囊對蝦。背景顏逡逑色代表序列保守程度。逡逑Ｆｉｇ．２．１．邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ａ／／ＡＴＰＩＦ１．邋Ａ．邋Ｎｕｃｌｅａｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｎｄ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ逡逑Ｍ／＇ＡＴＰＩＦｌ．邋Ｔｈｅ邋ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ邋ｉｓ邋ｓｍａｌｌｅｓｔ邋ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆＷ／＇ＡＴＰＩＦｌ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｔｅｄ邋ｉｎＭ／ＡＴＰＩＦ邋１邋ｍｕ逡逑Ｂ．邋Ｄｏｍａｉｎ邋ａｎ邋ａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ZfＡＴＰＩＦ１．邋Ｃ．邋ＡＴＰＩＦ１邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒ邋ｅｎｔ邋ｓｐｅｃｉｅｓ．邋Ｉｔ邋ｈａｓ逡逑Ｈｏｍｏ—ｓａｐｉｅｎｓ，邋Ｍｕｓ一ｍｍｃｕｌｕｓ

對ＡＴＰＩＦ１過表達(dá)后表達(dá)量上升逡逑為了探究kxＡＴＰＩＦ１在ＷＳＳＶ感染對蝦時的作用，通過ＲＮＡｉ將逡逑干擾（圖２．４Ａ和Ｂ），然后注射ＷＳＳＶ到日本囊對蝦中，提�。遥危翙z測ＩＥ１和逡逑ＶＰ２８的表達(dá)。結(jié)果顯示，在血細(xì)胞和腸中都被干擾掉，而被ＷＳＳＶ逡逑感染后２４ｈ和４８ｈ發(fā)現(xiàn)ＩＥ１和ＶＰ２８基因的表達(dá)顯著下降（圖２．５Ａ－Ｄ），進(jìn)一步逡逑的死亡率實驗表明，干擾后的對蝦存活率顯著升高（圖２．６Ａ）。逡逑將ｒｉ＾ＡＴＰＩＦｌ和ＷＳＳＶ的混合物注射進(jìn)日本囊對蝦體內(nèi)，在血細(xì)胞中可以逡逑檢測到１＊kx＿八丁？嚇１邋（圖２．４Ｃ），表明重組蛋白質(zhì)ｒ＾／ＡＴＰＩＦｌ可以進(jìn)入細(xì)胞。在病逡逑毒感染２４ｈ和４８ｈ后檢測ＩＥ１和ＶＰ２８的表達(dá)量，結(jié)果顯示，ZfＡＴＰＩＦ１蛋白質(zhì)逡逑過表達(dá)之后，不論是ＩＥ１還是ＶＰ２８的表達(dá)量在血細(xì)胞和腸中均顯著升高（圖逡逑２．５Ｅ－Ｈ）

■■■ＳＡ逡逑Ｉｒ／Ｗ／ＡＴＰＩＦＩ逡逑圖２．４．的ＡＴＰＩＦ丨的ＲＮＡｉ和過表達(dá)（注射重組蛋白）效果檢測。被１＾八丨后，逡逑血細(xì)胞中的檢測分析。辦ＧＦＰ為對照組。Ｂｊ＾ｒＰ／Ｆ／被ＲＮＡｉ后，腸中的場＾７７７７＝７逡逑檢測分析。對照組為出ＧＦ／＞。Ｃ．場ＡＴＰＩＦ１過表達(dá)后１邋ｈ，用熒光顯微鏡檢測ｒＡ々＿ＡＴＰＩＦｌ在血逡逑細(xì)胞中的定位，鼠抗Ｈｉｓ抗體作為一抗，并且將抗鼠的ＦＩＴＣ作為二抗。ＢＳＡ作為對照組。逡逑（＊ｐ＜０．０５）逡逑Ｆｉｇ．２．４．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＲＮＡｉ邋ａｎｄ邋ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎｊｅｃｔｅｄ）邋ｏｆ逡逑Ａ＾／ＡＴＰＩＦｌ．邋Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邐ｉｎ邋ｈｅｍｏｃｙｔｅ邋ａｎｄ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ＭｊＡＴＰＩＦＬ邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｉｓ邋ｄｓＧＦＰ．邋Ｂ．邋Ｔｈｅ邋ＲＮＡｉ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭｊＡＴＰＩＦｌ邋ｉｎ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．邋Ｃ．邋Ａｆｔｅｒ邋Ａ＾／ＡＴＰＩＦｌ逡逑ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｎｅ邋ｈｏｕｒ，邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｌｏｃａｔｅ邋ｒＡ／／ＡＴＰＩＦｌ邋ｉｎ邋ｎｕｃｌｅａｒ．邋Ｔｈｅ逡逑２４逡逑

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本文編號：2832572