文昌魚屬于頭索動物,在無脊椎動物進化到脊椎動物的進程中占據(jù)關鍵節(jié)點位置,是研究脊椎動物起源與進化的珍貴模式生物。先前的眾多研究表明,在文昌魚中存在類似于脊椎動物肝臟的組織被稱為肝盲囊。肝臟是脊椎動物特有器官,是維持糖代謝平衡的重要場所。那么文昌魚肝盲囊是否也具有類似的調(diào)節(jié)糖代謝功能呢?這是本文研究的主要問題。脊椎動物的葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)由三種同工酶組成,即G6Pase-Ⅰ、 G6Pase-Ⅱ和G6Pase-Ⅲ。它能催化葡萄糖-6-磷酸水解成為磷酸基和游離的葡萄糖,這個催化過程是糖異生和糖原分解的最后一個關鍵步驟,因此對血糖水平的調(diào)節(jié)具有十分重要的作用。目前有大量的研究針對的是脊椎動物中的葡萄糖-6-磷酸酶,但在無脊椎動物當中有關葡萄糖-6-磷酸酶的表達和調(diào)控的研究則十分有限。本文對文昌魚(Branchiostoma japonicum)中的葡萄糖-6-磷酸酶進行了鑒定,獲得了全長為2053 bp的互補脫氧核糖核苷酸序列,其中開放閱讀框為1095 bp,編碼364個氨基酸。通過序列比對發(fā)現(xiàn)此預測的蛋白序列與脊椎動物的三種G6Pase具有29.8%至39.1%的一致性,與無脊椎動物有20.4%至46.7%的一致性。雖然斑馬魚的G6Pase與文昌魚的序列一致性只有33.6%和38.8%,但是它們的3D結構具有驚人的相似性,暗示文昌魚G6Pase與斑馬魚G6Pase的功能也具有一定的相似性。有關進化樹、基因結構分析和共線性等分析結果顯示了文昌魚G6Pase與脊椎動物的G6Pase-Ⅲ具有更密切的關系。因此,文昌魚的G6Pase可能與脊椎動物G6Pase-Ⅲ類似,是G6Pase基因原型代表,而脊椎動物的三種G6Pase是在進化過程中經(jīng)過兩輪基因復制產(chǎn)生的。我們通過實時熒光定量聚合酶反應檢測到G6Pase在肝盲囊和卵巢中大量表達,具有組織特異性表達的特點。我們也證明了文昌魚肝盲囊和斑馬魚肝臟在經(jīng)過重組斑馬魚生長激素(rzGH)處理之后G6Pase的表達量呈現(xiàn)上升的趨勢。然后,利用rzGH進行長時間處理,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,rzGU仍舊具有促進作用�？偠灾�,rzGH所引起的G6Pase的表達模式和趨勢在文昌魚肝盲囊和斑馬魚肝臟中是相似的。通過蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)文昌魚肝盲囊提取物和鼠肝臟提取物都能與鼠抗人的G6Pase抗體發(fā)生結合,在大約40kDa的位置形成一條與我們所預測的蛋白大小近似的條帶,這證明了在文昌魚中存在天然的葡萄糖-6-磷酸酶。然后,我們通過測定肝盲囊,腸和去除兩者后的文昌魚提取物中的G6Pase活性,來定位該酶主要的表達部位。結果顯示肝盲囊中G6Pase的活性要比腸高出1.6倍,而在去除肝盲囊和腸的文昌魚提取物中其活性極其低。隨后,我們對文昌魚進行了饑餓和投喂處理,然后剖取肝盲囊進行G6Pase活性測定,與對照相比,G6Pase的活性在饑餓狀態(tài)下提高了82%,并且在攝食之后降低到原先活性的75%,而文昌魚肝盲囊中G6Pase活性的這種變化(在投喂之后降低,饑餓處理之后升高)與脊椎動物中觀測到的結果一致。總而言之,本文論述了文昌魚葡萄糖-6-磷酸酶在結構和功能方面都與脊椎動物相似。此外,文昌魚和斑馬魚在生長激素的刺激下G6Pase基因表現(xiàn)出了相似的表達模式和趨勢,表明G6Pase的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)在文昌魚中已經(jīng)發(fā)生了一定的進化。這些結果都為文昌魚肝盲囊與脊椎動物肝臟同源性并且在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用這一推論提供了有力證據(jù)。
【學位單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：S917.4

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本文編號：2826564