鯉皰疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus II,CyHV-2)是鯉皰疹病毒屬中一種具有強(qiáng)致病力的DNA病毒。近年來,由CyHV-2引起的異育銀鯽鰓出血病在江蘇鹽城地區(qū)大規(guī)模爆發(fā),致死率特別高,給異育銀鯽的養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失,生產(chǎn)上亟待開發(fā)安全高效的新型疫苗,應(yīng)用于異育銀鯽鰓出血病防治。1.CyHV-2新型疫苗的免疫效果評(píng)估本研究中基于桿狀病毒表面展示系統(tǒng)構(gòu)建了CyHV-2的ORF72與ORF66重組疫苗、CyHV-2的ORFD4核酸疫苗,并評(píng)估它們抗CyHV-2的免疫效果。將CyHV-2_ORF72基因與CyHV-2_ORF66基因分別克隆進(jìn)桿狀病毒表面展示載體pFastBac~(TM)Dual-P10-GP64CTD載體中,通過Bac to Bac系統(tǒng)獲兩種重組病毒,命名為BmNPV-P10-GP64-ORF72與Bm NPV-P10-GP64-ORF66。以1.0×10~(10)TU/尾的病毒量分別腹腔注射免疫異育銀鯽(體長7~13cm,體重35-60g),同設(shè)免疫等體積的生理鹽水作空白對(duì)照組,免疫后第3周通過競爭型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血液中抗體的效價(jià)水平。結(jié)果顯示免疫組(2組)與對(duì)照組抗體效價(jià)水平?jīng)]有明顯差異。表明基于桿狀病毒表面展示系統(tǒng)構(gòu)建的CyHV-2的ORF72與ORF66重組疫苗免疫異育銀鯽后,機(jī)體均沒有產(chǎn)生較高水平的特異性應(yīng)答。因此,選取CyHV-2(GenBank:KT387800)的衣殼蛋白(ORF66、ORF72)和膜囊蛋白(ORF81、ORF82)作為候選疫苗蛋白,通過抗原表位預(yù)測后,將ORF66、ORF72、ORF81、ORF82的抗原表位對(duì)應(yīng)的DNA序列串聯(lián),將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的序列克隆在β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子下游,構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體,通過Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組病毒,命名為BmNPV-FA-D4ORF。分別以注射和口服的方式免疫異育銀鯽(體長7~13cm,體重35-60g)。Bm NPV-FA-D4ORF通過腹腔注射免疫異育銀鯽(2.2×10~(13)TU/尾),同設(shè)BmNPV為陰性對(duì)照及空白對(duì)照組(等體積生理鹽水/尾)。在魚免疫后第1、2、3周通過PCR、RT-PCR的方法檢測免疫魚體中相關(guān)疫苗基因的DNA、RNA水平;免疫后第1、2周后,通過免疫組化的方法檢測免疫魚體脾臟、腎臟中疫苗基因蛋白水平的表達(dá);免疫后第1、2、3、4周分別通過競爭型-ELISA檢測抗體效價(jià)水平;免疫后第3周接種CyHV-2,評(píng)估免疫效果。結(jié)果顯示,BmNPV-FA-D4ORF注射魚體后能夠進(jìn)入魚組織,表達(dá)疫苗蛋白,并刺激魚產(chǎn)生特異性抗體,抗體水平在注射后的第三周達(dá)到最高水平。攻毒后,免疫組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的鰓出血病的發(fā)病率分別為7.69%、29.17%、38.46%。滴度為2.2×10~(11)TU/ml的Bm NPV-FA-D4ORF以1ml/g噴灑魚顆粒飼料(對(duì)照組中添加等體積生理鹽水),飼喂異育銀鯽,4周后,人工感染CyHV-2免疫組、空白對(duì)照組的鰓出血病的發(fā)病率分別為15.38%、25.93%。表明BmNPV-FA-D4ORF通過注射和口服的方式免疫,均對(duì)異育銀鯽鰓出血病有良好的免疫保護(hù)作用。將異育銀鯽浸泡免疫在500拷貝的BmNPV-FA-D4ORF/μl的水中,5h后取鰓、脾臟、血液進(jìn)行RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)浸泡免疫魚的脾臟、脾臟、血液中均檢測到了疫苗基因表達(dá),表明BmNPV-FA-D4ORF可以通過浸泡進(jìn)入魚體,并表達(dá)疫苗基因,暗示BmNPV-FA-D4ORF可以通過浸泡免疫異育銀鯽。2.CyHV-2的ORF72蛋白卵黃抗體的制備為了探討卵黃抗體應(yīng)對(duì)異育銀鯽鰓出病的防治效果,將CyHV-2的ORF72基因克隆進(jìn)PET28+(a)的載體中,然后在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),SDS-PAGE和Western-blot檢測結(jié)果顯示,ORF72在大腸桿菌中成功表達(dá),表達(dá)水平較高。篩選出高表達(dá)陽性克隆菌,再接種至發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)后,收集菌體,通過破碎、變性、復(fù)性、過Ni柱、洗脫、透析等一系列過程,從大腸桿菌中純化獲得可溶性的ORF72蛋白;通過免疫雞群,收雞蛋制備蛋粉共獲蛋粉約100千克。Western-blot檢測結(jié)果顯示,蛋粉中含有特異性的ORF72抗體,ELISA檢測結(jié)果顯示,蛋粉中的抗體效價(jià)在1:8000-16000,為測試卵黃抗體在鰓出血病防控中的效果奠定了基礎(chǔ)。3.異育銀鯽鰓出病魚卵中的CyHV-2的檢測基于CyHV-2的解旋酶基因(helicase)設(shè)計(jì)了引物,建立real time PCR檢測CyHV-2的技術(shù)。對(duì)患病異育銀鯽不同組織的檢測結(jié)果顯示,異育銀鯽的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、鰓的感染CyHV-2的程度存在顯著差異,腎臟感染程度最高,其次是脾臟和鰓,心臟的感染程度最低。魚卵逐粒檢測結(jié)果顯示,病魚的魚卵中,有12.5%可檢測到CyHV-2。病魚的魚卵的集團(tuán)檢測結(jié)果顯示,帶毒量為3.31拷貝的病毒/粒魚卵。對(duì)不同感染程度的病魚的魚卵檢測結(jié)果顯示,卵中CyHV-2的檢出水平與魚的感染程度呈一定的弱正相關(guān)性。這些結(jié)果表明CyHV-2可通過卵垂直傳遞給子代。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S941.41
【部分圖文】：

鯉皰疹病毒 II 型的 DNA 疫苗、卵黃抗體的研制及魚卵中鯉皰疹病d-GP64-ORF66。為了驗(yàn)證重組 Bacmid 中具有 ORF72 和 OR物對(duì) Bacmid-GP64-ORF72 和 Bacmid-GP64-ORF66 進(jìn)行 PCR以從 Bacmid-GP64-ORF72 和 Bacmid-GP64-ORF72 擴(kuò)增出與異性條帶（圖 1），分別為泳道 2 轉(zhuǎn)化菌與泳道 4 轉(zhuǎn)化菌，說重組至 Bacmid 中。

-P10-GP64-ORF72、Bacmid-P10-GP64-ORF66 轉(zhuǎn)染 BmN 下觀察細(xì)胞和轉(zhuǎn)染 Bacmid-P10-GP64-ORF72 的 BmN 細(xì)胞，B：正常 BmBacmid-P10-GP64-ORF66 的 BmN 細(xì)胞 Western 檢測重組蛋白 ORF72、ORF66 在病毒粒子中的：Bacmid-P10-GP64-ORF72 轉(zhuǎn)染 BmN 細(xì)胞后 3d 收上清超速離心kDa

23測重組蛋白 ORF72、ORF66 在10-GP64-ORF72 轉(zhuǎn)染 BmN 細(xì)胞后 ORF66 轉(zhuǎn)染 BmN 細(xì)胞后 3d 收上清鼠抗，CyHV-2-ORF66 自制鼠抗；鼠P64-ORF72 與 BmNPV-P10-GP4-ORF72 與 BmNPV-P10-GP64-的魚血作陰性對(duì)照，通過反競

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姜永萍;;我國首個(gè)DNA疫苗獲得批準(zhǔn)[J];農(nóng)業(yè)知識(shí);2018年24期

2 閆睿;;我國首個(gè)DNA疫苗獲得批準(zhǔn)[J];農(nóng)家之友;2018年08期

3 本刊輯;;我國首個(gè)DNA疫苗獲得批準(zhǔn)[J];江西畜牧獸醫(yī)雜志;2018年03期

4 陳靖;田源;白國輝;;靶向DNA感受器佐劑研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2018年06期

5 ;我國首個(gè)禽流感DNA疫苗獲得批準(zhǔn)[J];農(nóng)家書屋;2018年08期

6 ;我國首個(gè)禽流感DNA疫苗獲得批準(zhǔn)[J];北方牧業(yè);2018年12期

7 ;我國首個(gè)禽流感DNA疫苗獲得批準(zhǔn)[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2018年07期

8 宮強(qiáng);孔梁宇;牛明福;;禽多殺性巴氏桿菌ptfa基因殼聚糖納米DNA疫苗的制備與檢測[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2018年03期

9 黃丹;李樂山;楊文琳;孫匯苑;;免疫記憶與DNA疫苗[J];科技與創(chuàng)新;2018年07期

10 張錦鵬;張冠文;宣國云;張歡;姜東伯;楊琨;;溶酶體靶向的漢坦病毒包膜糖蛋白DNA疫苗的體液免疫評(píng)價(jià)和攻毒保護(hù)效果[J];中國免疫學(xué)雜志;2018年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 黃挺;康春蘭;趙克雷;范振鑫;張修月;岳碧松;;圈養(yǎng)林麝膿腫病病原菌化膿隱秘桿菌DNA疫苗研制及免疫效應(yīng)研究[A];四川省動(dòng)物學(xué)會(huì)第十屆會(huì)員代表大會(huì)暨第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2015年

2 趙以睿;張仁利;朱興全;;新型DNA疫苗佐劑-DC的研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第九次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2006年

3 李霄;金寧一;宋英今;李雪梅;李臻;王仁秋;王鐵柱;劉艷;季喜娟;;DNA疫苗制備工藝研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第六屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨第11次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2005年

4 齊蔓莉;劉全中;繳穩(wěn)苓;田敬群;陳錦英;;沙眼衣原體F型主要外膜蛋白基因的克隆[A];2001年中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

5 潘志明;焦新安;黃金林;唐麗華;張輝;張成全;劉秀梵;;攜帶新城疫病毒DNA疫苗鼠傷寒沙門氏菌的安全性和免疫效力試驗(yàn)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2004學(xué)術(shù)年會(huì)暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2004年

6 李素;王文成;涂長春;;DNA疫苗及生物安全[A];第一屆中國養(yǎng)豬生產(chǎn)和疾病控制技術(shù)大會(huì)——2005中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2005年

7 蔡宏;余大海;田霞;呼西旦;李淑霞;朱玉賢;;不同組合及組分結(jié)核桿菌多價(jià)DNA疫苗的保護(hù)效率比較研究[A];2005全國第二屆核酸疫苗研討會(huì)論文集[C];2005年

8 王斌斌;溫黎俊;;DNA疫苗在豬病防制中的研究應(yīng)用及其優(yōu)缺點(diǎn)分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第七屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2009年

9 吳曉娟;冷梅;趙大鵬;崔穎杰;張巖;汪春義;戚鳳春;郭新;付學(xué)奇;;帶有IL-2基因佐劑的乙肝病毒DNA疫苗構(gòu)建及其免疫效果的觀察[A];2006年全國生化與生物技術(shù)藥物學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

10 肖躍強(qiáng);張守峰;扈榮良;沈志強(qiáng);;狂犬病病毒糖/核蛋白“二價(jià)”DNA疫苗安全試驗(yàn)與田間免疫研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)成立大會(huì)暨第一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 見習(xí)記者 郝祖慧;H5亞型禽流感DNA疫苗斬獲今年首個(gè)一類新獸藥[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2018年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 任玉珊;CpG偶聯(lián)的HCV-E1E2糖基化突變體DNA疫苗及中和性單抗的篩選及驗(yàn)證[D];武漢大學(xué);2014年

2 任培森;大腸桿菌DH5α規(guī)�；a(chǎn)禽流感DNA疫苗的工藝及免疫應(yīng)用研究[D];吉林大學(xué);2018年

3 宋立強(qiáng);異種同源鈣激活Cl～-通道DNA疫苗對(duì)小鼠哮喘模型的防治作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 馬加海;熱休克蛋白70與MAGE-3融合蛋白疫苗和DNA疫苗的構(gòu)建及抑瘤效應(yīng)的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

5 郭瀛軍;豬帶絳蟲囊蟲病DNA疫苗的中試及免疫效力研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

6 格日勒?qǐng)D;雞柔嫩艾美爾球蟲（E.tenella）MZ5-7基因免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性試驗(yàn)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

7 張含;口服DNA疫苗防治實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜血管新生[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

8 卞繼峰;新型雙啟動(dòng)子DNA疫苗載體的研制及在人乳頭瘤病毒疫苗研究中的應(yīng)用[D];山東大學(xué);2003年

9 王中川;癌胚抗原DNA疫苗對(duì)特異性抗腫瘤免疫的激活及其效應(yīng)的增強(qiáng)策略[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 齊蔓莉;沙眼衣原體E型DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效果的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李坤;鯉皰疹病毒Ⅱ型的DNA疫苗、卵黃抗體的研制及魚卵中鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測技術(shù)[D];蘇州大學(xué);2018年

2 郭穎;鴿皰疹病毒全基因克隆及DNA疫苗的制備[D];東北林業(yè)大學(xué);2017年

3 宰金麗;日本血吸蟲TOR分子DNA疫苗和RNA干擾研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2017年

4 魏玉英;新型腫瘤基因疫苗載體的構(gòu)建及其抑瘤活性的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

5 葛金玲;IL-18協(xié)同單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的免疫學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2007年

6 趙玲瀟;基于泛素-弓形蟲多價(jià)抗原的重組疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性研究[D];山東大學(xué);2015年

7 郭佳;羅非魚無乳鏈球菌疫苗的制備及其免疫保護(hù)性研究[D];華中師范大學(xué);2013年

8 賀超;淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PⅠA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及免疫作用研究[D];華中科技大學(xué);2006年

9 曾宇青;鞭毛蛋白作為PRRSV核酸疫苗佐劑的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 蔣偉;狂犬病病毒、犬瘟熱病毒DNA疫苗實(shí)驗(yàn)免疫研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2814247