【摘要】：干擾素調節(jié)因子(Interferon regulatory factor,IRFs)是一類具有多種生物學功能的轉錄調節(jié)因子,在調節(jié)抗病毒免疫反應、免疫細胞的生長和分化以及腫瘤的形成中發(fā)揮重要的作用。目前,對脊椎動物干擾素調節(jié)因子及其介導的干擾素抗病毒免疫通路的研究已經(jīng)比較透徹,但是在海洋無脊椎動物中的研究還處于起步階段。本研究以長牡蠣(Crassostrea gigas)為研究對象,利用分子生物學、細胞生物學和生物信息學等相關技術,對長牡蠣IRF-1(命名為CgIRF-1)和IRF-8(命名為CgIRF-8)在干擾素系統(tǒng)中的調控功能進行了初步研究。CgIRF-1和CgIRF-8基因的開放閱讀框全長分別為990 bp和1425 bp,分別編碼229和473個氨基酸。CgIRF-1和CgIRF-8的氨基端高度保守,均包含典型的DBD結構域。對于羧基端,CgIRF-8含有典型的IAD1結構域;CgIRF-1與其他IRF-1/2家族中的分子一樣,不具有IAD結構域并且序列相似性比較低,含有并不保守的轉錄激活結構域。值得指出的是,CgIRF-1的后100個氨基酸中包含一些酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸,這些氨基酸被磷酸化后,IRF-1的轉錄活性增強。CgIRF-1和CgIRF-8 mRNA在各組織中均呈組成型表達,且都在血淋巴細胞中表達量最高。細胞內(nèi)定位顯示,CgIRF-1在長牡蠣血細胞的細胞核和細胞質中均有分布,而CgIRF-8主要分布于細胞質中。Poly(I:C)處理48小時后,長牡蠣血淋巴細胞中CgIRF-1 mRNA表達量顯著增加(p0.05)。原核重組表達蛋白CgIRF-1(rCgIRF-1)能夠在體外結合ISRE經(jīng)典基序。雙熒光素酶報告基因實驗顯示,CgIRF-1能夠顯著增強CgIFNLP的啟動子活性(p0.05),而CgIRF-8能夠顯著抑制CgIFNLP的啟動子活性(p0.05);共轉染實驗表明,CgIRF-1和CgIRF-8能夠協(xié)同抑制CgIFNLP的啟動子活性(p0.01)。以上研究結果表明,與脊椎動物相比,長牡蠣的干擾素因子家族成員CgIRF-1和CgIRF-8分子在結構上高度保守;CgIRF-1能夠響應poly(I:C)刺激引起的免疫應答,通過激活長牡蠣中干擾素系統(tǒng)調節(jié)抗病毒免疫應答反應;CgIRF-8則與CgIRF-1協(xié)同抑制干擾素系統(tǒng)防止機體出現(xiàn)過免疫反應。本研究為進一步研究長牡蠣干擾素調節(jié)因子家族成員的結構和功能奠定了重要的理論基礎,同時也為研究無脊椎動物干擾素系統(tǒng)的抗病毒免疫調節(jié)機制提供了參考。
【學位授予單位】：大連海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

圖 1-1 識別 RNA 病毒的模式識別受體[4]Fig 1-1 Pattern-recognition receptors (PRRs) for RNA virus recognitions 被誘導產(chǎn)生、分泌到胞外后，與分布于細胞表面的受體結合，激活 janus 激和轉錄激活因子 (janus kinase signal transducer and activator of transcription, 信號通路，進而發(fā)揮生物學效應。I 型 IFNs 與受體 IFNAR1 和 IFNAR2 結合，段 Tyr被 Tyk 2和 Jak磷酸化，募集信號轉導和激活轉錄因子 1 (signal transvator of transcription, STAT1) 和 STAT2。STAT1 和 STAT2 形成異源二聚體并被與 IRF-9 形成三聚體轉移進入核內(nèi)作用于干擾素刺激基因 (interferon stimuISGs) 啟動子區(qū)的干擾素刺激反應元件 (IFN-stimulated response element，ISR下游基因轉錄[32, 33]。 型 IFN 與受體 IFNGR1 和 IFNGR2 相結合，受體胞活的 JAK1 和 JAK2 磷酸化后招募 STAT1，STAT1 形成同源二聚體，被磷酸核內(nèi)，結合到 IFN-γ激活位點 (gamma-interferon-activation sites, GAS)，最終的表達[34]。 型 IFNs 結合受體后，STAT1 和 STAT2 發(fā)生磷酸化，與 IRF-9錄復合體，誘導下游基因的轉錄表達，最終發(fā)揮抗病毒、抗增殖和免疫調節(jié)，效應分子通過 3 種途徑發(fā)揮抗病毒作用分別是：Mx (Myxovirus-resistant)白激酶 PKR (Double-stranded RNA-activated protein kinase) 通路，2′-5′-寡聚

N、ISG 和其它密切相關基因的表達而發(fā)揮多種生物學效應[38]。目前 經(jīng) 鑒 定 出 了 11 種 IRFs， 分 別 是 IRF-1 、IRF-2 、IRF-/ICSAT、IRF-5 、IRF-6 、IRF-7 、IRF-8/ICSBP 和 IRF-9/ISGF3γ/p48其中 IRF11 只在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)[39]。所有的 IRFs 成員在其氨基端都含角-螺旋型的 IRF 結構域，又稱為 DNA 錨定結構域 (DBD)，它可以反應原件 (ISRE：A/GNGAAANNGAAACT) 的 DNA 序列 （如圖 4-6 個保守的色氨酸殘基 (Trp)，這 5 個保守的殘基對識別含有 5’-GADNA 序列具有重要作用[40]。除了 IRF-1 和 IRF-2，脊椎動物 IRFs 的 結構域 (IAD1)，這是一個與 Smad 家族的 MH2 結構域相似的結構域F 成員或其他的轉錄調節(jié)因子發(fā)生同源或異源二聚化[29] [41]。IRF-1 和個 IAD2 結構域，是由 PEST 結構域（富含脯氨酸，谷氨酸，絲氨外，IRF-1 的羧基端還具有保守性很低的激活結構域（在 IRF-1 的多個酪氨酸）；IRF-2 的羧基端具有抑制結構域（在 IRF-2 的最后 2酸，精氨酸和賴氨酸）[42, 43]。IRFs 蛋白結構中的 DBD 和 IAD 決定因調節(jié)中所發(fā)揮的不同作用。

圖 3-3 CgIRF-8 與其他脊椎動物 IRF-8 的多序列比對MART 預測長牡蠣 CgIRF-8 的蛋白結構。(B) 脊椎動物和無脊椎動物 IRF-8比對。方框內(nèi)分別為 IRF結構域 (DBD)和 IRF-3 結構域 (IAD1)。）Fig. 3-3 Multiple sequence alignment of CgIRF-8 with other IRF-8 from inverteprotein structure of CgIRF-8 from C. gigas predicted by SMART. (B) Comparisoes of the IRF-8 from invertebrates. Inside the box are the amino acid sequence o(DBD) and IRF-3domain (IAD1).)EGA6.0 軟件，應用 neighbour-joining (NJ) 算法對 CgIRF-1和 Cg以及 NCBI 上已知的其它物種的 IRFs 家族序列構建進化樹。有 建進化樹，結果顯示所有構建進化樹的 IRFs 分子除了分成了 4 個一些特異性的分支（如圖 3-4）。結果顯示，CgIRF-1 首先與一支，然后與 CgIRF2-binding protein-like 聚到一起。而 CgIRF-1 與不同的亞支，但是與 IRF-1 家族中的其他 IRFs 聚為一群。CgIR，沒有與脊椎動物中的 IRF-4 家族聚為一支，而是被分出來單獨形

【參考文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 辛魯生;長牡蠣白介素17及其信號通路分子的作用機制[D];中國科學院研究生院(海洋研究所);2016年

相關碩士學位論文 前1條

1 孫穎;長牡蠣腫瘤壞死因子（CgTNF-1）免疫調節(jié)機制的初步研究[D];中國科學院研究生院（海洋研究所）;2014年

本文編號：2807075