發(fā)布時間：2020-08-26 02:01

【摘要】：鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),是一種高致病性雙鏈DNA病毒。因該病毒是第2個分離自鯉科魚類的皰疹病毒,國際病毒系統(tǒng)分類與命名委員會(ICTV)將其命名為鯉皰疹病毒2型,該病毒屬于魚皰疹病毒科(Alloherpesviridae),鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)。本研究建立了定量檢測CyHV-2的微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并且與實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)方法就其靈敏性、特異性、重復(fù)性和臨床樣品檢測作了比較分析。結(jié)果表明,與RT-qPCR相比,ddPCR具有相同的特異性,其靈敏性比RT-qPCR方法低20倍。在定量CyHV-2 DNA時,ddPCR(R2=0.994)和RT-qPCR(R2=0.994)均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,并且這兩種檢測方法的定量值呈正相關(guān)(R2=0.989)。但是,在定量檢測相同稀釋度CyHV-2 DNA時,RT-qPCR的定量值始終比ddPCR高10倍。ddPCR的組內(nèi)和組間重復(fù)變異系數(shù)(CV)各為0.59%-11.26%和6.55%-23.21%,而RT-qPCR各為16.57%-27.56%和22.31%-56.73%,說明ddPCR具有更好的穩(wěn)定性。在臨床樣品定量檢測時,ddPCR的檢出率稍高于RT-qPCR。本研究建立的ddPCR能夠準確定量檢測CyHV-2,將為CyHV-2相關(guān)研究提供有益參考。為獲得可檢測CyHV-2的單鏈抗體,本研究利用噬菌體抗體庫技術(shù),經(jīng)過4輪淘選富集后獲得2株抗CyHV-2單鏈抗體(scFv)。Dot blot結(jié)果分析表明,2個可溶性單鏈抗體均能特異性識別CyHV-2;Western blot結(jié)果顯示,2個可溶性單鏈抗體的分子量約為27 kDa。由免疫組化試驗結(jié)果可知2個可溶性單鏈抗體均能檢測到CyHV-2在肝組織和鰓組織中的分布。ELISA試驗結(jié)果表明可溶性單鏈抗體均不與CyHV-3、EHNV、CCV、ISNV發(fā)生交叉反應(yīng)。本研究期望能為CyHV-2的快速檢測提供借鑒,并為CyHV-2檢測試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S941.4

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本文編號：2804514