【摘要】：蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的寄生于對(duì)蝦肝胰腺組織的新病原,2009年泰國(guó)養(yǎng)殖的生長(zhǎng)緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦首次發(fā)現(xiàn)并命名。盡管蝦肝腸胞蟲不會(huì)引起對(duì)蝦的死亡,但它與對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢有關(guān)。早期死亡綜合征或者急性肝胰腺壞死病(AHPND/EMS)引起的蝦高致死率使得人們將更多的注意力集中到AHPND/EMS上面,忽視了蝦肝腸胞蟲造成的影響,這使得蝦肝腸胞蟲的傳播越來(lái)越廣泛,有信息表明在中國(guó)、印度尼西亞、馬來(lái)西亞、越南、印度和泰國(guó)中都有檢出。本文從實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法的建立、人工感染實(shí)驗(yàn)、肝腸胞蟲的寄生數(shù)量與對(duì)蝦生長(zhǎng)相關(guān)性幾個(gè)方面進(jìn)行研究。根據(jù)Genbank中公布的對(duì)蝦肝腸胞蟲SSU r DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,通過對(duì)引物的特異性以及靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明引物具有良好的特有性和較高的靈敏度。利用p MD18-T構(gòu)建含有SSU r DNA序列的重組質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行多次優(yōu)化建立了肝腸胞蟲SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示,構(gòu)建的方法擴(kuò)增循環(huán)數(shù)與目的基因拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系,且Tm值為60℃時(shí)擴(kuò)增效果最好,熔解曲線僅有一個(gè)單一的特異峰,擴(kuò)增所的擴(kuò)增產(chǎn)物閾值循環(huán)數(shù)(Ct)與模板起始量的對(duì)數(shù)標(biāo)的準(zhǔn)曲線為Ct=-3.369log(Sq)+39.364,相關(guān)系數(shù)R2=0.992,擴(kuò)增效率為98.5%。利用建立的熒光定量方法檢測(cè)了海南采集的31份個(gè)體生長(zhǎng)大小不均勻的凡納濱對(duì)蝦樣品,肝腸胞蟲的陽(yáng)性檢出率為67.7%,高于常規(guī)PCR檢測(cè),而且通過溶解曲線分析特異性良好,表明該方法具備較好的適用性。建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有特異、靈敏、快速、定量的優(yōu)點(diǎn),可為肝腸胞蟲進(jìn)行快速檢測(cè)以及定量研究提供參考。人工感染實(shí)驗(yàn)利用凡納濱對(duì)蝦幼蝦和鹵蟲進(jìn)行,用冰凍和鮮活的的感染有肝腸胞蟲的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織去投喂健康的凡納濱對(duì)蝦,投喂一周后的樣品套式PCR檢測(cè)結(jié)果顯示投喂冰凍和鮮活肝胰腺組織病料都可以使健康幼蝦感染肝腸胞蟲。說(shuō)明肝腸胞蟲的孢子能夠抵抗較差的外界環(huán)境,低溫冰凍后仍然具有感染力,這也為生產(chǎn)上肝腸胞蟲的預(yù)防和治療帶來(lái)了麻煩。鹵蟲感染實(shí)驗(yàn)樣品套式PCR檢測(cè)結(jié)果顯示為陰性,利用實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性。說(shuō)明肝腸胞蟲感染鹵蟲后并沒有在鹵蟲體內(nèi)大量繁殖,但是肝腸胞蟲可以在鹵蟲體內(nèi)寄生存活。在對(duì)蝦肝腸胞蟲的流行病學(xué)調(diào)查過程中,我們采集了山東即墨、江蘇贛榆以及海南儋州三個(gè)地區(qū)生長(zhǎng)緩慢且個(gè)體大小差異明顯的凡納濱對(duì)蝦樣品,并測(cè)量了這幾批凡納濱對(duì)蝦的體長(zhǎng),懷疑這幾批樣品是因?yàn)楦腥緦?duì)蝦肝腸胞蟲而導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢,并且出現(xiàn)個(gè)體大小差異的明顯癥狀,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法分析了肝腸胞蟲對(duì)這幾批凡納濱對(duì)蝦樣品生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)WSSV、IHHNV、CMNV、AHPND四種病原進(jìn)行PCR檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示這幾種病原的檢出率很低。Real-time PCR檢測(cè)肝腸胞蟲結(jié)果顯示海南儋州肝腸胞蟲檢出率為68%,江蘇贛榆和山東即墨樣品肝腸胞蟲全部為陽(yáng)性。利用本方法對(duì)采集自江蘇、海南和山東的三批凡納濱對(duì)蝦共94份的肝胰腺組織DNA(Hp DNA)中的EHP SSU r DNA進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果表明EHP的載量指數(shù)與對(duì)蝦生長(zhǎng)速率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,肝胰腺中EHP載量在103 copies/(ng Hp DNA)時(shí)代表了較高的風(fēng)險(xiǎn)水平。本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有特異、靈敏、快速、定量的優(yōu)點(diǎn),所建立的方法及檢測(cè)數(shù)據(jù)可為EHP的防控提供技術(shù)和參考。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S945.4
【圖文】：

除了EHP的常規(guī)PCR為陽(yáng)性的樣品有擴(kuò)增曲線外，其余樣品以及陰性對(duì)照均沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)。將實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2-2），結(jié)果顯示，只有EHP陽(yáng)性樣品泳道有與目的產(chǎn)物分子量大小一致的產(chǎn)物條帶，其余泳道均為陰性，進(jìn)一步說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物的特異性。圖2-1 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物ENF185和ENR185的擴(kuò)增曲線Fig. 2-1 Amplification curve of specific detection of microsporidian E. hepatopenaei圖2-2 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳M. DL2000；1. EHP的PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的凡納濱對(duì)蝦樣品總DNA；2. WSSV純病毒基因組EHPOtherpathogens

對(duì)蝦總DNA、HPV陽(yáng)性的中國(guó)明對(duì)蝦總DNA、純化WSSV的核酸、感染副溶血弧菌的凡納濱對(duì)蝦總DNA、健康凡納濱對(duì)蝦總DNA以及水為模板的空白對(duì)照，用引物ENF185和ENR185進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增曲線（圖2-1）顯示，除了EHP的常規(guī)PCR為陽(yáng)性的樣品有擴(kuò)增曲線外，其余樣品以及陰性對(duì)照均沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)。將實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2-2），結(jié)果顯示，只有EHP陽(yáng)性樣品泳道有與目的產(chǎn)物分子量大小一致的產(chǎn)物條帶，其余泳道均為陰性，進(jìn)一步說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物的特異性。圖2-1 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物ENF185和ENR185的擴(kuò)增曲線Fig. 2-1 Amplification curve of specific detection of microsporidian E. hepatopenaei圖2-2 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳M. DL2000；1. EHP的PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的凡納濱對(duì)蝦樣品總DNA；2. WSSV純病毒基因組EHPOtherpathogens

8.3 × 101copies/μL之間均有較強(qiáng)的熒光信號(hào)（圖2-3），而且擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S曲線，在模板濃度為8.3 ×100copies/μL時(shí)經(jīng)40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，未檢測(cè)到擴(kuò)增的熒光信號(hào)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR至少可以檢測(cè)到8.3 ×101copies的模板，具有較高的靈敏度。常規(guī)PCR采用8.3 ×1058.3 ×101copies/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)為模板，經(jīng)35循環(huán)擴(kuò)增后產(chǎn)物凝膠電泳分析，結(jié)果顯示該對(duì)引物通過常規(guī)PCR能檢測(cè)到的最低為8.3 ×102copies/μL的模板，但是在該濃度下電泳條帶亮度特別弱，幾乎看不到（圖2-4）。說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR至少比常規(guī)PCR定性檢測(cè)的靈敏度高1個(gè)數(shù)量級(jí)。圖2-3 蝦肝腸胞蟲SSU rDNA的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)模板的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.2- 3 Amplification curve of qPCR for E. hepatopenaei SSU rDNA with plasmid strandardtemplates8.3×1088.3×1078.3×1068.3×1058.3×1048.3×1038.3×1028.3×1018.3×100

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2781075