【摘要】：海洋微生物多樣性高,分布廣泛,既是初級(jí)生產(chǎn)者又是分解者,與浮游植物、浮游動(dòng)物共同組成“微食物環(huán)”,在海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)運(yùn)輸與能量傳遞中起到承上啟下作用,是參與海洋生物地球化學(xué)循環(huán)不可或缺的一環(huán)。因此,了解海洋微生物的多樣性、群落結(jié)構(gòu)及其功能顯得尤為重要。已有的研究主要集中在自然海域微生物的群落特征,對(duì)海水養(yǎng)殖區(qū)尤其是大型海藻栽培區(qū)微生物群落特征所知甚少。為揭示大型海藻栽培區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)及功能,本研究以廣東省汕頭市南澳島龍須菜栽培區(qū)和相鄰自然海區(qū)(對(duì)照區(qū))為調(diào)查海域,通過(guò)采集不同季節(jié)、不同水深的樣品,提取DNA并進(jìn)行16S rRNA MiSeq高通量測(cè)序及功能基因芯片(GeoChip)雜交,比較了大型海藻龍須菜栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)微生物群落差異,分析了龍須菜體表附生微生物組成及功能,旨在探討龍須菜規(guī)模栽培對(duì)微生物群落的影響及其分子機(jī)理。所獲結(jié)論對(duì)海洋環(huán)境保護(hù)和生物資源可持續(xù)利用具有重要科學(xué)意義。主要研究結(jié)果如下:1.于2014年4月,在南澳島深澳灣龍須菜栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)各設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)。每個(gè)采樣點(diǎn)均采集表層水體、底層水體和沉積物,提取DNA并純化后,進(jìn)行16S rRNA基因Mi Seq測(cè)序。結(jié)果顯示,18個(gè)樣品共產(chǎn)生超過(guò)530,000條高質(zhì)量序列,生成3454個(gè)OTU(Operational Taxonomic Units),分別屬于28個(gè)門(mén),74個(gè)綱,134個(gè)目,275個(gè)科,618個(gè)屬。群落差異性檢驗(yàn)(adonis)結(jié)果表明,龍須菜栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)表層水體微生物群落結(jié)構(gòu)差異不明顯,但底層水體和沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著(p0.05)。在表層和底層水體中,擬桿菌、α-變形菌和γ-變形菌均為優(yōu)勢(shì)菌,其相對(duì)豐度在栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)中有差異。沉積物中優(yōu)勢(shì)菌為擬桿菌、γ-變形菌和ε-變形菌。在屬水平上,栽培區(qū)表層水體中Aestuariibacter,Crocinitomix,Leucothrix(亮發(fā)菌屬)及Tenacibaculum(黃桿菌屬)的相對(duì)豐度高于對(duì)照區(qū)(p0.05)。底層水體中,栽培區(qū)Aestuariibacter,Bacillariophyta(硅藻門(mén))和Croceitalea的相對(duì)豐度高于對(duì)照區(qū)(p0.05)。沉積物中,Arenibacter,Glaciecola,Halomonas(鹽單胞菌屬),Leisingera(亮發(fā)菌屬),Maribacter,Peredibacter和Sulfitobacter(亞硫酸桿菌)在龍須菜栽培區(qū)的相對(duì)豐度高于對(duì)照區(qū)(p0.05)。大型海藻栽培區(qū)相對(duì)豐度高的微生物種屬與利用海藻多糖的微生物密切相關(guān),例如Arenibacter,Croceitalea,Glaciecola,Leucothrix和Maribacter。響應(yīng)比分析表明,栽培區(qū)表層和底層水體中顯著變化的OTU分別有89.9%和72%增加了相對(duì)豐度;栽培區(qū)沉積物中顯著變化的OTU有84.5%降低了相對(duì)豐度。CCA結(jié)果顯示,栽培區(qū)水體微生物群落結(jié)構(gòu)變化與溫度、DO、pH和Chl-a相關(guān),而對(duì)照區(qū)水體微生物群落結(jié)構(gòu)變化與鹽度和總氮密切相關(guān)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明,表層及底層水體中顯著變化的OTU與溫度、pH和DO正相關(guān)(p0.01),與鹽度和總氮負(fù)相關(guān)(p0.01)。沉積物中顯著變化的OTU與總氮、總硫正相關(guān)(p0.01),與總碳負(fù)相關(guān)(p0.01)。對(duì)上述結(jié)果綜合分析,提出了龍須菜栽培對(duì)微生物影響的概念模型:龍須菜栽培可以提高水中溶解氧,降低營(yíng)養(yǎng)鹽,從而改善水質(zhì),對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)演變產(chǎn)生影響。該模型為研究大型海藻與微生物相互作用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。2.為進(jìn)一步研究龍須菜栽培對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,于2014年12月至2015年7月在龍須菜栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)進(jìn)行每月一次的連續(xù)采樣調(diào)查,對(duì)微生物樣品進(jìn)行16S rRNA基因MiSeq測(cè)序,探討龍須菜生長(zhǎng)對(duì)微生物群落動(dòng)態(tài)變化的影響。利用adonis進(jìn)行群落差異性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采樣時(shí)間、龍須菜生物量變化及水深均對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響(p0.01);同樣,龍須菜栽培、采樣時(shí)間對(duì)不同水層微生物群落結(jié)構(gòu)亦有顯著影響(p0.05)。Adonis分析發(fā)現(xiàn),龍須菜栽培區(qū)與對(duì)照區(qū)水體微生物群落結(jié)構(gòu)在1-2月(p0.05)和4-5月(p0.01)均有顯著差異,尤其是1米深和底層水體。NMDS分析結(jié)果表明,微生物群落在不同月份形成不同聚類(lèi),說(shuō)明龍須菜栽培時(shí)間導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)差異。利用線性回歸分析α-多樣性與栽培時(shí)間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)栽培區(qū)表層水體微生物群落隨著龍須菜栽培生物量的增加而降低,其余水層及對(duì)照區(qū)均無(wú)線性關(guān)系。而且,微生物群落α-多樣性與龍須菜生物量呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明龍須菜對(duì)栽培區(qū)表層水體微生物群落具有一定的選擇作用,使得栽培區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單。基于Bray-Curtis距離分析了龍須菜栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)隨著龍須菜栽培時(shí)間的變化,結(jié)果表明,表層水體中兩者微生物群落結(jié)構(gòu)差異隨栽培時(shí)間而增加(p0.05),1米深及底層水體無(wú)線性增加關(guān)系。線性回歸分析結(jié)果表明,龍須菜栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)表層、1米和底層水體微生物群落β-多樣性均隨著龍須菜生物量的增加而增加,且龍須菜栽培區(qū)表層和1米深水體微生物群落β-多樣性增加得更快,說(shuō)明龍須菜栽培加快了微生物群落的演替速率。CCA結(jié)果顯示,龍須菜生長(zhǎng)初期(1-3月)微生物群落結(jié)構(gòu)與DO、NO_3~-、NO_2~-、TP正相關(guān),龍須菜生物量較大時(shí)(4-5月)微生物群落結(jié)構(gòu)與pH、TN正相關(guān),說(shuō)明龍須菜栽培改變了微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子,龍須菜栽培對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)及組成具有選擇性,并驅(qū)動(dòng)了微生物群落演替加快。3.為研究龍須菜規(guī)模栽培對(duì)微生物群落功能的影響,于2014年12月-2015年7月分別采集了龍須菜栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)1米水體,利用功能基因芯片GeoChip5.0分析微生物群落功能隨龍須菜栽培時(shí)間的變化情況。同時(shí),于2015年5月采集了龍須菜栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)表層、1米、水深一半、水深75%及底層水體,利用GeoChip 5.0分析龍須菜栽培對(duì)微生物群落功能的影響。結(jié)果顯示,龍須菜栽培區(qū)和對(duì)照區(qū)的微生物群落功能隨著龍須菜生物量的增加而出現(xiàn)顯著差異,尤其是在龍須菜生物量較大的四月和五月。栽培區(qū)氮循環(huán)中nrfA,nir,nasA基因豐度增加,基因amoA豐度降低,提高了生態(tài)系統(tǒng)中NH_4~+的含量,有利于龍須菜的吸收利用。同時(shí),龍須菜栽培改變了不同水層微生物群落功能特征,尤其是1米及底層水體。1米深水體微生物群落參與碳降解及有機(jī)污染物修復(fù)的大多數(shù)基因在龍須菜栽培區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度低于對(duì)照區(qū)。環(huán)境因子在影響微生物群落功能上起到重要作用。功能基因的改變、龍須菜生物量、環(huán)境因子及其相互作用可能反映了大型海藻-微生物-環(huán)境之間的復(fù)雜關(guān)系,龍須菜栽培能夠調(diào)控微生物群落功能,微生物群落功能的時(shí)空變化為揭示海水養(yǎng)殖對(duì)微生物群落功能影響提供了科學(xué)依據(jù)。4.為研究龍須菜體表附生微生物群落的結(jié)構(gòu)及功能,于2015年4月采集南澳島深澳灣新鮮龍須菜藻體,利用16S rRNA和ITS擴(kuò)增子測(cè)序、功能基因芯片GeoChip 5.0等高通量技術(shù)對(duì)龍須菜體表和龍須菜周?chē)w微生物群落進(jìn)行了比較。群落差異性檢驗(yàn)表明兩者在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、真菌群落結(jié)構(gòu)及群落功能上均有顯著差異(p0.05)。龍須菜體表微生物群落的多樣性(Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))均低于周?chē)w,但均勻度(Simpson均勻度)高于周?chē)w,說(shuō)明龍須菜體表微生物群落結(jié)構(gòu)更加單一。測(cè)序結(jié)果表明,與藻類(lèi)相關(guān)、具有溶藻特性及降解海藻多糖能力的微生物類(lèi)群在龍須菜體表遠(yuǎn)多于周?chē)w,如Croceitalea,Formosa,Granulosicoccus(顆粒狀球菌屬),Leucothrix,Polaribacter(極地桿菌屬),Aureobasidium(短梗霉)。GeoChip 5.0分析表明,多數(shù)參與生物地球化學(xué)循環(huán)的基因在龍須菜體表微生物群落豐度較低,但是同化氮還原,硫/硫化物氧化及除草劑相關(guān)的基因在體表群落有較高豐度。此外,重金屬解毒、植物激素、干旱脅迫、生物膜形成等與海藻表面生活相關(guān)的基因在體表微生物群落中表現(xiàn)出較高豐度,說(shuō)明為適應(yīng)海藻體表生活,龍須菜體表微生物群落保留或選擇了特定種類(lèi)和功能類(lèi)群。綜上所述,龍須菜規(guī)模栽培對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)具有重要影響。栽培區(qū)水體、沉積物及龍須菜體表中有關(guān)海藻及可利用海藻多糖的微生物種屬明顯多于自然海區(qū),龍須菜對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)及功能具有較強(qiáng)的選擇性。通過(guò)本研究,揭示了微生物在龍須菜栽培生態(tài)系統(tǒng)生物地球化學(xué)循環(huán)中的作用,論證了龍須菜體表附生微生物對(duì)龍須菜正常生長(zhǎng)的重要性,提出了龍須菜規(guī)模栽培對(duì)微生物群落影響的概念模型,闡釋了其相互作用的分子機(jī)理。所獲結(jié)論為揭示海水養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S968.434
【圖文】：

24icrobial community composition in surface water (a), bottom water (b) and sevel. *: p < 0.05, **: p < 0.01 by ANOVA test.層水體(a)、底層水體(b)及沉積物(c)中微生物群落組成在屬水平的差異分p < 0.01)

Fig. 2-7 Significantly changed OTUs in surface water (a), bottom water (b) and sediment (c) atGZ analyzed by response ratio at 95% confidence interval.圖 2-7 龍須菜栽培區(qū)表層水體(a)、底層水體(b)和沉積物(c)中顯著變化 OTU 的響應(yīng)比分析The phylogenetic tree revealed the characteristics and distribution patterns ofdominant microbial groups (relative abundance > 1%) in the water column andsediment at both zones using the neighbor-joining method of MEGA 5. In the surfacewater, OTUs belonging to Aestuariibacter, Crocinitomix, Polaribacter,Tenacibaculum, unclassified Flavobacteriaceae and unclassified-Microbacteriaceaeexhibited higher abundances (p < 0.05) at GZ than at CZ (Fig. 2-8). In the bottomwater, OTUs belonging to Aestuariibacter, Bacillariophyta and Haliea showed higherabundances (p < 0.05) at GZ compared to CZ (Fig. 2-9). The OTUs in sedimentaffiliated with Arenibacter, Glaciecola, Leisingera, Sulfitobacter and Peredibacter

暨南大學(xué)博士學(xué)位論文 大型海藻龍須菜栽培生態(tài)系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)及功能研究At 1-m depth water samples, positive relationships were observed between PO43-,temperature, salinity, or pH and cultivation time, while there were negativerelationships between DO and cultivation time (p < 0.05). The increase in rates ofPO43-, temperature, and pH were greater in GW1m than in CW1m. However, theslopes of salinity and DO of CW1m were steeper than that of GW1m (Fig. 3-2). Inbottom water samples, PO43-, temperature, salinity and pH showed a positiverelationship with cultivation time, while the DO had a negative correlation withcultivation time (p < 0.05). Among these regressions between environmental factorsand cultivation time, the slopes of PO43-and pH in GWB were steeper compared toCWB. The slopes of temperature and salinity in GWB were flatter than those of CWB(p < 0.05) (Fig. 3-3).

本文編號(hào)：2772909