【摘要】：本文以斑馬魚為研究對象,通過亮甲酚藍染色法判斷卵母細胞成熟度和采用不同濃度、不同處理時間17α-羥基孕酮處理斑馬魚卵母細胞,對斑馬魚卵母細胞體外促成熟進行研究;通過采用不同配方玻璃化凍存液凍存,并結(jié)合凍存后細胞存活率的檢測,對斑馬魚卵母細胞玻璃化凍存條件進行篩選;通過檢測凍存后細胞中三種線粒體ATP酶(Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Na+K+-ATP酶)的活性和谷胱甘肽含量變化,對玻璃化冷凍保存對斑馬魚卵母細胞的損傷作用等進行研究。主要研究結(jié)果如下:(1)比較通過亮甲酚藍染色法和卵母細胞直徑大小、細胞形態(tài)判斷卵母細胞成熟度的結(jié)果,判定亮甲酚藍染色法用于斑馬魚卵母細胞成熟度的評估可行且更便捷。篩選出亮甲酚藍染色濃度為20μmol/L、染色時間為150min的染色效果最佳。(2)實驗以不添加17α-羥基孕酮的培養(yǎng)液為對照組,以濃度分別為1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L的17 a-羥基孕酮培養(yǎng)液為實驗組,對斑馬魚卵母細胞進行體外培養(yǎng)6 h、12 h和24 h,以亮甲酚藍染色法評價卵母細胞的體外成熟情況。結(jié)果表明:1)17α-羥基孕酮對斑馬魚卵母細胞的存活率沒有明顯影響;2)17α-羥基孕酮濃度為1 nmol/L、10 nmol/L處理6 h,卵母細胞的成熟率分別為50.99%和44.30%,但與對照組比較差異不顯著,因此推斷低濃度的17α-羥基孕酮(1 nmol/L和10 nmol/L)對斑馬魚卵母細胞的成熟無明顯促進作用;17α-羥基孕酮濃度為1000 nmol/L處理6 h,卵母細胞的成熟率分別為33.30%,與對照組相比成熟率下降明顯,說明高濃度的17α-羥基孕酮(1000 nmol/L)對卵母細胞的成熟反而不利;17α-羥基孕酮濃度為100 nmol/L、處理12 h后,成熟率為40.72%,顯著高于對照組(p0.05),對卵母細胞成熟有明顯的促進作用。3)17α-羥基孕酮濃度在1-1000 nmol/L區(qū)間處理6小時,斑馬魚卵母細胞半成熟的比率隨孕酮處理濃度的增加而增加,都高于對照組,且在100 nmol/L和1000nmol/L劑量組半成熟的卵母細胞比率分別達47.92%和56.48%,與對照組相比差異顯著(p0.05),說明17α-羥基孕酮對卵母細胞在成熟的過程中有一定的促進作用,且孕酮濃度越大效果越明顯。(3)設置9組(V1~V9)配方不同的玻璃化液對斑馬魚卵母細胞進行玻璃化凍存(-196℃),分別檢測凍存1d、2d、4d和8d后卵母細胞的存活率,結(jié)果表明:V4組的存活率最高,且顯著高于其它組,其卵母細胞存活率在凍存1d、2d、4d和8d后分別為48.89±2.58%、39.35±1.34%、24.18±2.32%和14.56±1.64%,凍存1-2d效果較好,但隨著凍存時間的增加,卵母細胞存活率明顯下降;該玻璃化液組分是:1.5mol/L甲醇、6.0mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖。(4)對玻璃化凍存后斑馬魚卵母細胞的線粒體ATP酶的活性和谷胱甘肽含量進行了研究。結(jié)果表明:1)各實驗組Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Na+K+-ATP酶活性在凍存1d、2d、4d和8d后均顯著下降,其中V4組的各種酶活性相對較高,經(jīng)檢測其Ca2+-ATP酶活性在凍存1d、2d、4d和8d后分別為:3.823±0.144U/mgprot、3.492±0.084U/mgprot、2.554±0.097U/mgprot和1.930±0.076U/mgprot;Mg2+-ATP酶活性分別為4.503±0.144 U/mgprot、4.134±0.182U/mgprot、2.972±0.096U/mgprot和2.113±0.073 U/mgprot;Na+K+-ATP酶活性分別為7.520±0.198 U/mgprot、5.828±0.184 U/mgprot、3.204±0.197 U/mgprot和2.031±0.176 U/mgprot。2)各實驗組的谷胱甘肽含量經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)也是隨著冷凍保存天數(shù)的增加而顯著下降,其中V4組的谷胱甘肽含量顯著高于其它組,其含量在凍存1d、2d、4d和8d后分別為13.37±0.59mgGSH/gprot、10.57±0.73 mgGSH/gprot、6.25±0.89 mgGSH/gprot和4.16±0.57 mgGSH/gprot。3)綜合分析各項檢測數(shù)據(jù)結(jié)果表明,細胞的活性隨著凍存天數(shù)的增加而逐漸下降,說明玻璃化凍存不能完全避免低溫和冷凍保護劑的毒性對卵母細胞造成損傷。
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2769667