【摘要】：甲殼動(dòng)物有著堅(jiān)硬的表皮,也被稱為外骨骼,作用是維持其物種特異性形態(tài),保護(hù)并使之與外部環(huán)境隔離。甲殼動(dòng)物通過周期性蛻去舊的表皮產(chǎn)生新表皮來進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育。表皮主要由幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)與碳酸鈣構(gòu)成,表皮蛋白(cuticle proteins,CPs)與幾丁質(zhì)結(jié)合形成纖維骨架控制表皮的鈣化,對(duì)新表皮的形成起到極其重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),咪唑類物質(zhì)KK-42能顯著縮短日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)幼蝦的蛻皮周期,推測(cè)CPs可能是其作用的靶分子。CPs作為主要的結(jié)構(gòu)性蛋白,理論上,其表達(dá)水平及其表達(dá)的時(shí)序性改變會(huì)影響表皮的厚度,進(jìn)而影響蛻皮周期的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)榛A(chǔ),通過NCBI Conserved Domain Search篩選含chitin_bind_4結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)基因,采用qRT-PCR技術(shù)定量研究相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)及KK-42處理后基因表達(dá)的變化,分析它們與蛻皮周期之間的聯(lián)系,為闡明KK-42縮短日本沼蝦蛻皮周期的機(jī)制積累資料。將500尾體長(zhǎng)3.0±0.5 cm的日本沼蝦分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液浸泡1 min,對(duì)照組用不含KK-42溶液處理。于處理后0、3、6、12、24和48 h,取處于C、D0-2、D3-4和A期的尾扇、腹肢和步足表皮提取mRNA,用于后續(xù)研究。結(jié)果如下:根據(jù)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)CPs基因的先后順序,將篩選出的3個(gè)基因分別命名為MnCP-6、MnCP-7和MnCP-8,已在NCBI GENEBANK數(shù)據(jù)庫注冊(cè),注冊(cè)號(hào)分別為KY399478、KY3399479和KY411918。通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度分別為373 bp、759 bp和1183 bp。經(jīng)NCBI Blastx比對(duì),MnCP-6與端足蟲(Hyalella azteca,XP_018010163.1)相似性為70%,使用CutProtFam-Pred推測(cè)為編碼RR-2家族蛋白;MnCP-7與端足蟲(Hyalella azteca,XP_018010157.1)相似性為73%,推測(cè)同屬于RR-2家族。MnCP-8與豌豆長(zhǎng)管蚜(Acyrthosiphon pisum,XP_001950806.2)相似性為43%。上述3個(gè)MnCPs的轉(zhuǎn)錄水平在蛻皮周期的不同階段以及不同的表皮組織呈現(xiàn)明顯的差異。以尾扇中表達(dá)量為參照,在C期、D0-2期以及D3-4期,步足MnCP-6表達(dá)量腹肢;A期,步足中表達(dá)量腹肢。MnCP-7在C期與A期表達(dá)情況類似,腹肢中表達(dá)步足;在D0-2期各組織內(nèi)表達(dá)水平相當(dāng);D3-4期步足表達(dá)量最高。在C期、D0-2期和D3-4期,步足MnCP-8表達(dá)最高;A期,腹肢中表達(dá)量最大。KK-42處理可顯著上調(diào)上述3個(gè)基因的表達(dá),其中,尾扇MnCP-6基因在C、D3-4期被誘導(dǎo)的表達(dá)量顯著升高;步足MnCP-7基因表達(dá)量在C期升高,至D0-2期呈下降趨勢(shì);在D3-4和A期,腹肢中MnCP-8表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4;Q78
【圖文】：

構(gòu)組分的血藍(lán)蛋白又稱血藍(lán)素，過去被稱為呼吸蛋白，最新研的貯存、滲透壓的維持及蛻皮過程的調(diào)節(jié)有關(guān)，其裂解產(chǎn)生的關(guān)。血藍(lán)蛋白功能多樣，涉及到激素、酚類和一些 CPs 的轉(zhuǎn)運(yùn)目的和意義對(duì)蛻皮的影響生物 KK-42，化學(xué)結(jié)構(gòu)為 1-苯甲基-5-[(E)-2,6-二甲基-1,5-庚二烯 kuwano 等人發(fā)現(xiàn)，作為保幼激素拮抗物主要用于蠶養(yǎng)殖業(yè)，卵巢發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn) KK-42 可以明顯促進(jìn)家蠶幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育

第三章 結(jié)果蝦總 RNA 提取結(jié)果 TaKaRa RNA 提取試劑盒，從對(duì)照組和 KK-42 處理后 0、組中，分別提取處于 C、D0-2、D3-4和 A 期的日本沼蝦尾扇 OD260/280的值在 1.8～2.2 之間，并使用凝膠電泳檢測(cè)表明 RNA 可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。下圖為 C 期 RNA 電泳圖。

GENEBANK 數(shù)據(jù)庫注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)分別為 KY399478、KY3399479 和 KY411918。通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度分別為 373 bp(圖 3-2)，759 bp(圖 3-4)、1183 bp(圖 3-6)；經(jīng) NCBI Blastx 比對(duì)，MnCP-6 與端足蟲(hyalella azteca, XP_018010163.1)相似性為 70%(圖 3-3)，使用CutProtFam-Pred 推 測(cè) 為 編 碼 RR-2 家 族 蛋 白 。 MnCP-7 與 端 足 蟲 (Hyalellaazteca ,XP_018010157.1)相似性為 73%(圖 3-5)，推測(cè)同屬于 RR-2 家族。MnCP-8 與豌豆長(zhǎng)管蚜( acyrthosiphon pisum，XP_001950806.2) 相似性為 43%(圖 3-7)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2763572