【摘要】：隨著生物基礎(chǔ)研究的深入,對基因的功能探究一向是生命科學(xué)研究的重要課題之一,不單單是在了解生物發(fā)育的現(xiàn)象上具有重要的理論意義,也會影響到生產(chǎn)實踐的應(yīng)用。脂肪肉瘤轉(zhuǎn)運(yùn)/肉瘤融合蛋白(Fus)是一種參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控與前體mRNA剪切的一種RNA結(jié)合蛋白。據(jù)先前的實驗報道,在哺乳動物中突變FUS會導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病,包括肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)。然而,關(guān)于fus的功能在魚類中的報道卻很少。本研究中,我們以斑馬魚(Danio rerio)作為模式生物,探究fus在魚類中的功能。斑馬魚fus定位于第3號染色體上,由14059 bp個堿基組成,cDNA長度為1626 bp,共編碼541個氨基酸,其編碼序列包含RNA超家族識別結(jié)構(gòu)域(RRM superfamily)和鋅指家族與包含鋅指區(qū)的RNA結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)(ZnF_-RBZ)的兩個結(jié)構(gòu)域�；谠摶虻墓δ芙Y(jié)構(gòu)域,我們選取基因組上盡量靠近翻譯起始密碼子的合適的靶位點,利用近年來廣泛使用的CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚中對fus產(chǎn)生可遺傳的等位基因移碼突變,通過子代雜交的方式獲得純合的fus突變體。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在斑馬魚幼魚與成魚軀體的發(fā)育過程中,通過測量fus~(-/-)純合突變體與對照組的體長與體重,相對于對照組(wide type,WT)野生型斑馬魚來看,發(fā)現(xiàn)突變體斑馬魚的體長與體重均有顯著減小,但身體發(fā)育卻無明顯異常并且完全可育。除此之外,在野生型斑馬魚中常見的雌魚身體比例大于雄魚的性別異形現(xiàn)象在fus~(-/-)純合突變體中被消除了。進(jìn)一步研究生長發(fā)育信號通路中較為關(guān)鍵的幾種生長相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)gh1,ghra,igf1,igf2a,stat5.1和socs6基因的表達(dá)水平在突變體斑馬魚的早期幼魚發(fā)育階段顯著低于野生型斑馬魚。然而,相對于WT,在fus~(-/-)純合突變體斑馬魚中,其運(yùn)動能力并未受到影響。本研究表明,不同于它在哺乳動物中的功能,fus在斑馬魚中與運(yùn)動神經(jīng)元的發(fā)育不相關(guān)但在調(diào)節(jié)魚類軀體生長發(fā)育與兩性生長異形方面有著不同的功能。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位論文蛋白與 mRNA 通過有限的模式化的 RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBDs）相構(gòu)的不同排列呈現(xiàn)的這些 RBD 的多個拷貝來擴(kuò)增底物的結(jié)構(gòu)多蛋白質(zhì)的功能。其中包括 RNA 識別結(jié)構(gòu)域（RRM），異質(zhì)核 RKH），鋅指結(jié)構(gòu)域（Znf）等等（Lunde et al 2007）。常見的 RNA別 RNA 如圖 1-1（Fig.1-1）所示。

30圖 3-1 斑馬魚 fus 的時空表達(dá)（A）斑馬魚胚胎發(fā)育各時期 fus 的表達(dá)；（B）斑馬魚各組織 fus 的表達(dá)Fig. 3-1 Space-time expression of zebrafish fus(A) Expression of fus during embryonic development; (B) Diffferent tissue expression of zebrafish fus3.3 斑馬魚 fus CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建3.3.1 斑馬魚 fus CRISPR/Cas9 敲除靶位點的設(shè)計根據(jù) Ensembl 中斑馬魚 fus 的信息（ENSDARG00000037968），本試驗選擇斑馬魚最完整的轉(zhuǎn)錄本來作為 CDS 序列通過 CRISPR/Cas9 進(jìn)行靶位點的篩選。依照CRISPR/Cas9 基 因 靶 位 點 的 設(shè) 計 原 則 ， 選 擇 靶 位 點 的 序 列 為 ：

fus 在斑馬魚生長發(fā)育中的功能研究ATGGAGGACAGTC。將選取的靶位點在 Ensembl 數(shù)據(jù)庫與斑馬，顯示靶位點位于斑馬魚 3 號染色體 fus 上（圖 3-2A 和圖 3-2B組上特異性較高。選取的靶位點在 CDS 序列上對應(yīng)的位置為 4應(yīng)在第 14-21 個氨基酸上，位于 RRM 結(jié)構(gòu)域與鋅指結(jié)構(gòu)域之前as9 基因敲除靶位點設(shè)計的基本要求。A

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2748052