【摘要】：水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控一直是漁業(yè)生產(chǎn)關(guān)注的焦點(diǎn)�？股厥羌�(xì)菌性疾病防控的有效藥物,但長(zhǎng)時(shí)間使用,會(huì)使病原體產(chǎn)生耐藥性。因此,篩選抗生素替代品,有效控制細(xì)菌性疾病是疾病防控的重要內(nèi)容�？咕氖且活惥哂锌咕钚缘年�(yáng)離子多肽,可有效殺滅細(xì)菌,避免產(chǎn)生耐藥性,具有替代抗生素的潛在價(jià)值。本研究通過(guò)克隆淇河鯽(Carassius auratus)組蛋白H2B基因的全長(zhǎng)序列,并提取HLP 1對(duì)應(yīng)的編碼區(qū)N端部分序列,對(duì)其分子特征進(jìn)行分析;采用熒光定量PCR方法,對(duì)H2B組織表達(dá)及對(duì)嗜水氣單胞菌的響應(yīng)進(jìn)行研究;對(duì)HLP 1原核重組表達(dá)和人工合成HLP 1的抑菌活性進(jìn)行研究�；诓嫖矝�(Letalurus punetaus)編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)引物。從淇河鯽鰓、腎、脾和肝中提取總RNA,通過(guò)RT-PCR技術(shù)獲得c DNA第一鏈作為模板,擴(kuò)增出淇河鯽H2B基因中間片段,將片段連接到p MD 19-T載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α中,克隆測(cè)序獲得H2B中間片段長(zhǎng)375 bp。根據(jù)已獲得H2B中間片段,分別設(shè)計(jì)一組用于3?UTR和5?UTR擴(kuò)增的特異性引物,通過(guò)巢式PCR方法分別擴(kuò)增出3?UTR 410 bp和5?UTR 32bp的片段,拼接得到淇河鯽組蛋白H2B基因全長(zhǎng)817 bp。ORF Finder預(yù)測(cè)組蛋白H2B ORF長(zhǎng)375 bp,編碼134個(gè)氨基酸。在線軟件預(yù)測(cè)組蛋白H2B分子量為13.61 k Da,等電點(diǎn)PI值為10.37,帶有18個(gè)正電荷,為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。組蛋白H2B二級(jí)結(jié)構(gòu)中含較多α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲,少量β折疊和延伸鏈。使用Bio Edit分析包括親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的斑馬紋草雀(Taeniopygia guttata)在內(nèi)的14個(gè)物種的H2B編碼區(qū)序列發(fā)現(xiàn),它們和淇河鯽的同源性都在75%以上,其中與斑馬魚(yú)((Danio rerio)同源性更是高達(dá)90.7%。HLP 1是組蛋白H2B N末端21個(gè)氨基酸組成的多肽,含有豐富的堿性氨基酸。根據(jù)組蛋白H2B序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增出HLP 1,并成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PET-32a-HLP 1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),篩選出陽(yáng)性菌落加入到含AMP的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600nm在0.6-0.8之間,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后沉淀、洗滌、裂解菌體,收集裂解液,然后通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳,成功檢測(cè)出融合蛋白。采用RT-q PCR方法檢測(cè)了淇河鯽組蛋白H2B及HLP 1基因在鰓、腎臟、脾臟、肝臟和頭腎中的表達(dá),正常情況下組蛋白H2B m RNA在肝臟中表達(dá)量最高,腎臟和頭腎次之,在鰓和脾臟中表達(dá)量較少,HLP1在頭腎中表達(dá)量最高,肝臟次之,其余組織中的表達(dá)水平和H2B相似。魚(yú)體注射嗜水氣單胞菌后48 h內(nèi),H2B和HLP 1 m RNA表達(dá)量在各組織中明顯上調(diào)。人工合成淇河鯽多肽HLP 1,將HLP 1以2倍濃度梯度稀釋為200μg/m L、100μg/m L、50μg/m L和25μg/m L,隨著HLP 1濃度的升高,抑菌圈直徑逐漸擴(kuò)大,且25 ug/ml HLP 1即能達(dá)到100mg/m L氨芐的抗菌水平,說(shuō)明HLP 1抗菌活性很高,其在水生動(dòng)物特別是魚(yú)類抗病和免疫中能起到重要作用。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

、腎、脾中提取總 RNA，使用 1.5%瓊脂糖凝膠s 比較亮，5 s 比較弱（圖 2-1），說(shuō)明 RNA 提取果顯示鰓、腎、脾的質(zhì)量濃度分別為 1021 ng/μL/280nm都在 1.8-2.0 之間。

組蛋白H2B的5RACE克隆和3RACE克隆

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2742861