【摘要】：作為世界上三大養(yǎng)殖蝦類之一,斑節(jié)對蝦以其生長率高,個體大,口味獨(dú)特,營養(yǎng)價(jià)值高,耐鹽性和在國際市場上持久需求等方面的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)于其它品種。但是,目前,斑節(jié)對蝦在其養(yǎng)殖上存在兩個主要問題,一個是疾病,另一個是苗種。缺乏特異性免疫反應(yīng)和免疫記憶的斑節(jié)對蝦在面對疾病時只能依靠先天免疫系統(tǒng),先天免疫是協(xié)助限制感染的第一道防線,但疾病問題仍然難以控制,斑節(jié)對蝦遭受著一系列不良環(huán)境毒性因子的影響,如病原體,酸堿度,重金屬污染等。Peroxiredoxins(Prxs)是自然界中普遍存在的,多功能的和進(jìn)化上保守的過氧化物還原酶類,其可以保護(hù)細(xì)胞免受ROS引起的氧化損傷,在發(fā)育,凋亡,分化和免疫反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。因此,本研究的目的是探討Prxs超家族成員對免疫和應(yīng)激反應(yīng)的作用。在本實(shí)驗(yàn)中,我們鑒定,克隆和表達(dá)了來自斑節(jié)對蝦的三個Prxs基因,包括PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn,通過其研究了解過氧化物還原酶Prxs超家族,以幫助緩解對蝦目前面臨的部分養(yǎng)殖難題。在本研究中,PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn的部分cDNA序列是從我們實(shí)驗(yàn)室斑節(jié)對蝦轉(zhuǎn)錄組庫中獲得。通過分子生物學(xué)技術(shù),克隆得到了PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn基因的全長。為研究斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖中三種基因存在的潛力,首先,對斑節(jié)對蝦的每個組織進(jìn)行qRT-PCR以初步了解這三種基因在斑節(jié)對蝦的分布;在細(xì)菌免疫感染和不同的環(huán)境毒性脅迫后,檢測鰓和肝胰腺組織中三種基因的轉(zhuǎn)錄模式,推測它們是否參與免疫應(yīng)激防御過程;此外,表達(dá)并純化三種基因的重組蛋白,測試重組蛋白的抗氧化活性;體外分析研究了三個蛋白的抗菌活性;測試了它們與重金屬和H_2O_2的關(guān)系。具體研究內(nèi)容概括如下:(1)在此,從斑節(jié)對蝦克隆出全長Prx1 cDNA序列(PmPrx1),全長PmPrx1 cDNA為951個堿基對(bp),編碼198個氨基酸的多肽。qRT-PCR結(jié)果顯示PmPrx1 mRNA在所有測試組織中普遍表達(dá),并且在免疫相關(guān)組織(鰓,肝胰腺)中具有相對較高的表達(dá)水平。為探索PmPrx1的免疫和抗應(yīng)激作用,選擇鰓和肝胰腺作為斑節(jié)對蝦的實(shí)驗(yàn)組織,對斑節(jié)對蝦用細(xì)菌(哈維弧菌和無乳鏈球菌)感染和有毒環(huán)境因子進(jìn)行脅迫。為進(jìn)一步闡明PmPrx1參與細(xì)菌刺激的免疫功能,采用原核表達(dá)方法獲得重組PmPrx1蛋白,通過愈創(chuàng)木酚法評估了重組PmPrx1的抗氧化活性,并且結(jié)果顯示PmPrx1蛋白以劑量依賴性和溫度依賴性的方式表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性。通過固體中瓊脂糖擴(kuò)散法和液體中進(jìn)行的細(xì)菌生長抑制試驗(yàn)評估了純化的PmPrx1蛋白的抗菌活性。此外,pRSET-PmPrx1轉(zhuǎn)染的大腸桿菌對重金屬毒性和H_2O_2氧化應(yīng)激具有顯著抗性。(2)作為Prxs超家族中唯一一個獨(dú)特的非典型2-Cys過氧化物還原酶,Prx5具有特殊的性質(zhì),如其酶促機(jī)制,廣泛的亞細(xì)胞分布和對過氧化物和過氧亞硝酸鹽的高親和力。本實(shí)驗(yàn)中,我們在斑節(jié)對蝦中獲得了Prx5 cDNA全長序列(命名為PmPrx5),全長Prx5 cDNA序列為1686 bp,含有76 bp的5'非翻譯區(qū)(UTR),1040 bp的3'UTR和一個570 bp的開放閱讀框,編碼189個氨基酸殘基,預(yù)測分子量為20 kDa,理論等電點(diǎn)為6.29。具有兩個核苷酸序列(AAA),具有poly(A)尾和兩個聚腺苷酸化信號序列(AATAAA)。系統(tǒng)進(jìn)化樹和多重序列比對表明,PmPrx5與其他物種的Prx5蛋白具有很強(qiáng)的同源性,如與含有高度保守功能域的脊尾白蝦(69%)和羅氏沼蝦(69%)具有高相似性。在所有測試的組織中普遍檢測到PmPrx5 mRNA。在斑節(jié)對蝦感染病原菌,應(yīng)激于高低滲透壓,酸堿性海水以及重金屬脅迫后,隨著時間的推移,除了在金屬銅和鎘的刺激后PmPrx5轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)外,在其他情況下,鰓和肝胰腺中PmPrx5 mRNA表達(dá)顯著增加。在大腸桿菌(DE3)中純化的重組PmPrx5蛋白在一定程度上表現(xiàn)出抗氧化活性和抗菌性質(zhì)。最后,pRSET-PmPrx5轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在應(yīng)對重金屬毒性應(yīng)激時得到顯著保護(hù)。(3)斑節(jié)對蝦中的PmPrxn被成功鑒定,克隆和依靠原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了蛋白表達(dá)。組織特異性表達(dá)分析顯示PmPrxn在斑節(jié)對蝦所有測試組織中普遍表達(dá),在肝胰腺中的表達(dá)水平最高,隨后是鰓和卵巢。qRT-PCR分析表明,當(dāng)斑節(jié)對蝦遭受生物和非生物脅迫時,包括哈維氏弧菌,無乳鏈球菌感染和毒性環(huán)境刺激后,PmPrxn mRNA表達(dá)具有獨(dú)特性,表明PmPrxn可能在響應(yīng)生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。然后,成功評估出純化的PmPrxn蛋白在體外研究中具有抗菌性質(zhì)。此外,DE3-pRSET-PmPrxn被顯著保護(hù)以抵抗重金屬毒性�？傊�,這項(xiàng)研究提供了關(guān)于PmPrx1,PmPrx5,PmPrxn在防御各種毒性因子中的有用信息,這些有助于進(jìn)一步闡明Prxs的功能。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4
【圖文】：

eus monodon）俗稱黑虎蝦，草蝦蝦科、對蝦屬。由于斑節(jié)對蝦生價(jià)值高、耐鹽度高、適合大規(guī)模其在國際市場т深受人們喜愛[1]蝦之 ，也是中國重要щ受歡迎[2]。斑節(jié)對蝦在印度洋-太平洋區(qū)以及墨西哥灣北部也有發(fā)現(xiàn)。斑

圖 1-1 哺乳動物 Prxs 結(jié)構(gòu)示意圖[28]Fig. 1-1 Structure diagram of Prx family in mammalian腹果蠅中有 5 種亞型被發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌中 3 種斑節(jié)對蝦中有 6 種，包括 種新型 2-CysPrx（],在植物里，17 種 Prxs 由 4 個亞家族，包括 1-Crxs 組成[31]。及功能研究進(jìn)展 Prxs 是 種重要的膜內(nèi)蛋白酶，但只有 Prx4 可號序列分泌出膜行使功能，哺乳動物中的 Pr

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