【摘要】：中華絨螯蟹俗稱河蟹、大閘蟹,是我國主要的淡水養(yǎng)殖蟹類。在養(yǎng)殖過程中,雄蟹生長快,攻擊性強,容易導致雌蟹死亡;養(yǎng)殖后期雌蟹性早熟會降低商品規(guī)格。單性化養(yǎng)殖是提高中華絨螯蟹養(yǎng)殖效益的有效途徑,因此,有必要開展中華絨螯蟹性別調控機制方面的研究,為實現單性化苗種繁育提供理論基礎。促雄腺是雄性甲殼動物特有的腺體,其分泌的激素為促雄腺激素,具有調控雄性分化、維持雄性第二性征和生長調節(jié)的功能。本研究分別對增殖期和分泌期促雄腺轉錄組和miRNAs進行測序分析,篩選與促雄腺發(fā)育相關的基因,并預測這些基因可能參與的調控通路�？寺×酥腥A絨螯蟹促雄腺基因(Es-IAG)的全長序列,并進行了表達分析和干擾研究,為中華絨螯蟹性別分化研究奠定了基礎。利用IlluminaHiseq平臺,對中華絨螯蟹增殖期和分泌期促雄腺進行轉錄組測序,比較轉錄組分析表明,兩個轉錄組共得到72000條基因,其中差異表達基因4027條;GO分析顯示,差異表達基因的功能主要集中在蛋白質的合成和分泌等生物學過程,并富集到轉錄、翻譯及信號轉導的相關通路中;進一步篩選出可能參與精巢發(fā)育及雄性性征維持的相關基因為Es-IAG,TRA-2,Cytochrome p450,SRY,和FTZ-F1;可能參與精子發(fā)生調控的相關基因為Ubiquitin、serpin、CathepsinA和CathepsinD;核糖體通路中44條基因表達顯著上調,2條顯著下調,說明了分泌期促雄腺中促雄腺激素的分泌量增加的原因。有3條基因被注釋為胰島素受體基因,在胰島素信號通路中發(fā)揮重要調控作用,通過不同信號通路參與調控促雄腺細胞的增殖分化、細胞凋亡和蛋白合成。其中,Unigene10231被注釋到卵母細胞成熟與減數分裂通路中,提示可能與卵細胞成熟有關,CL1931.Contig3可能是胰島素樣生長因子的受體,與生長相關。分析了刺激神經的配體受體相互作用通路,在分泌期,褪黑素受體、5-羥基色胺受體1基因的表達量顯著下調,提示5-羥基色胺和章魚胺通過促雄腺調控精巢發(fā)育;章魚胺受體的表達量顯著上調,章魚胺與攻擊、交配行為正相關,提示章魚通過促雄腺調控雄性爭斗和交配行為的機制。利用從轉錄組中獲得的Es-IAG片段,通過RACE技術,克隆Es-IAG基因的全長cDNA序列,并對其進行生物信息學分析,結果發(fā)現,中華絨螯蟹粗雄性激素的氨基酸序列與藍蟹(C.sapdus)的序列一致性最高,為44%,其次是擬穴青蟹(S.paramamosain),相似性達42%。中華絨螯蟹促雄腺激素前體多肽中存在分泌型信號肽,說明該激素為分泌型蛋白,共存在兩個糖基化位點,未發(fā)現跨膜結構域;在促雄腺激素前體多肽的C鏈和A鏈,C鏈和B鏈之間存在典型的R**R蛋白酶酶切位點,提示促雄腺激素前體多肽是在切除C鏈后成為成熟的促雄腺激素的,成熟肽鏈中的6個保守的Cys殘基形成兩個鏈間二硫鍵和一個鏈內二硫鍵,在三維結構上與其它甲殼動物保守位點的一致性,充分說明了甲殼類動物IAG基因的序列結構在關鍵位點的進化上是高度保守的。與其它已報道的甲殼動物促雄腺激素氨基酸序列做系統進化分析,發(fā)現中華絨螯蟹和藍蟹、擬穴青蟹的親緣關系最近,并與果蠅、廄螯蠅聚為一支。利用熒光定量PCR技術,檢測中華絨螯蟹16個連續(xù)發(fā)育時期LAG基因的表達情況,包括受精卵、囊胚期、原腸期、眼點期和心跳期,以及蚤狀幼體、大眼幼體和幼蟹Ⅰ～Ⅴ期雄體,結果發(fā)現,雄性Ⅰ期幼蟹體內Es-IAG基因的表達量顯著升高,外部形態(tài)觀察發(fā)現,Ⅰ期幼蟹開始出現性別相關附肢的分化,預示著Ⅰ期幼蟹階段是中華絨螯蟹性別分化的關鍵期。根據Es-IAG基因序列設計3個SiRNA,干擾扣蟹體內Es-IAG的表達,注射24小時后,利用熒光定量PCR檢測Es-IAG基因的表達情況,其中SiRNA-391的干擾效率達到67%。利用浸泡法干擾大眼幼體中Es-IAG基因的表達,能顯著抑制Ⅰ期幼蟹雄性附肢的發(fā)育。利用HiSeq高通量測序技術,檢測中華絨螯蟹增殖期和分泌期促雄腺中small RNA的表達情況,共篩選出已知miRNA3719條,差異表達的miRNA有2246條,其中1780條在分泌期促雄腺中的表達量顯著下調,466條顯著上調。預測其中Let-7可能參與了精巢的發(fā)育,以Es-IAG為靶基因的miRNA有27個,預測其中miR-197、miR-2443和miRNA-6368可能參與促雄腺的發(fā)育調控;通過GO分析,發(fā)現靶基因富集的生物學功能主要包括生物組分的合成、代謝、信號轉導、細胞部分和綁定等,這些功能與促雄腺的增殖、分泌和調控功能密切相關。差異表達miRNA中,以性別發(fā)育相關基因為靶基因的miRNA,可能是參與性別發(fā)育的關鍵miRNA。共篩選出65個新miRNA,功能主要集中于生理調節(jié)、細胞過程、代謝過程及信號轉導等生物學過程,為進一步揭示中華絨螯蟹性別調控奠定了基礎。
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
【圖文】：

＾邐－Ｊｆｃ—逡逑１刖ｇ逡逑中華線螯蟹■圖１－１），俗名河蟹，屬甲殼綱，十足目，方蟹科，逡逑絨螯蟹屬，其適應能力強，生長速度快，營養(yǎng)價值高，是我國重要的淡水養(yǎng)殖蟹類。中逡逑華絨螯蟹自然分布于我國渤海、黃海與東海諸岸，自長江口的崇明島到湖北省、浙江省逡逑是我國著名長江水系中華絨螯蟹的主產地，其中以陽澄湖大閘蟹品質最佳，久負盛名。逡逑自上世紀８０年代突破中華絨螯蟹人工育苗技術以來，人工養(yǎng)殖區(qū)不斷向內陸擴大，遍逡逑布全國各地（趙乃剛等，１９８８），目前中華絨螯蟹規(guī)�；B(yǎng)殖區(qū)主要集中在江蘇、安徽、逡逑湖北等省，２０１４年，國內總產量達到了邋７５萬噸，創(chuàng)歷史新高。經多年實踐積累，中華逡逑絨螯蟹人工養(yǎng)殖技術和產業(yè)化模式日漸成熟，各地根據資源優(yōu)勢逐漸形成了苗種繁育、逡逑扣蟹養(yǎng)殖、成蟹養(yǎng)殖等不同特色的產業(yè)化基地

邐山東農業(yè)大學博士學位論文算公式如下：逡逑ｄ＜ｖ－逡逑ｐ�。纾氩汀瑰义希澹蹂澹╁义辖涍^多重檢驗校正后，選擇ＱｖａｌｕｅＳ０．０５的Ｐａｔｈｗａｙ定義為在差異表達基因著富集的Ｐａｔｈｗａｙ。Ｑ－ｖａｌｕｅ和ＦＤＲ類似，都是對ｐ－ｖａｌｕｅ的一種校正。某一個假檢驗的Ｑ－ｖａｌｕｅ就是ＦＤＲ的最小值，在這些ＦＤＲ下該假設檢驗可以被認為是顯的。逡逑比較轉錄組分析流程圖：逡逑

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本文編號：2734716