【摘要】：近年來(lái),隨著石斑魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展,我國(guó)的石斑魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量已經(jīng)接近10萬(wàn)噸。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,各種細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲(chóng)等疾病頻發(fā),造成石斑魚(yú)大量死亡,給石斑魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中,哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起石斑魚(yú)病害中最重要的病原之一。本文利用從患病的美洲黑石斑中分離鑒定得到的哈維氏弧菌CJG-1株,對(duì)其生長(zhǎng)特性以及制備滅活疫苗的最佳條件進(jìn)行探究,利用哈維氏弧菌感染美洲黑石斑,探討對(duì)美洲黑石斑(Centropristis striata)血清指標(biāo)和組織中的相關(guān)免疫基因表達(dá)的影響,以及制備全菌滅活疫苗對(duì)美洲黑石斑進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn),探究對(duì)免疫相關(guān)基因在不同組織中的免疫應(yīng)答影響,最后通過(guò)人工感染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疫苗對(duì)美洲黑石斑的免疫保護(hù)效果,主要內(nèi)容如下:(1)對(duì)CJG-1哈維氏弧菌進(jìn)行活化培養(yǎng),條件180 rpm、28℃進(jìn)行培養(yǎng),定時(shí)檢測(cè)菌液濃度,得出哈維氏弧菌CJG-1株的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期為4-12 h;利用活化培養(yǎng)12h的菌液制備全菌滅活疫苗,甲醛濃度設(shè)置梯度為0、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,分別放置在4℃、28℃條件下,滅活24h,經(jīng)疫苗質(zhì)量和安全性檢測(cè)后,得到滅活疫苗最佳條件為甲醛濃度0.2%,28℃,滅活24h。(2)對(duì)美洲黑石斑腹腔注射0.2ml,1×10~8 cfu/ml的CJG-1哈維氏弧菌菌液,進(jìn)行人工感染試驗(yàn),測(cè)定0h(感染前)、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h血清中的溶菌酶、堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo),結(jié)果顯示4種酶活性均不同程度地升高且顯著高于對(duì)照組,說(shuō)明美洲黑石斑在受到病菌感染時(shí),機(jī)體抗感染的各項(xiàng)指標(biāo)均增強(qiáng)來(lái)抵抗相關(guān)的損害因子對(duì)機(jī)體的傷害。(3)人工感染后,在0h(感染前)、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h共9個(gè)時(shí)間點(diǎn),靜脈取血后,快速解剖取脾臟、頭腎、肝臟、鰓4種組織于裝有RNA保存液的離心管中,用于后期RNA提取并反轉(zhuǎn)成cDNA,利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)TLR2、MyD88、HSP70的特異性引物,以β-action為內(nèi)參,采用RT-PCR技術(shù),檢測(cè)3種基因在4種組織中的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示,TLR2和MyD88在脾臟和肝臟中上調(diào)倍數(shù)最顯著,分別為9.3和21倍以及9.9和5.9倍,頭腎中的MyD88在6h時(shí)迅速上調(diào)至峰值2.3倍,鰓中MyD88在36h時(shí)上調(diào)8.3倍;頭腎與鰓中的HSP70反應(yīng)迅速,在18h上調(diào)至最大倍數(shù)為11.2和10.7倍,肝臟和脾臟分別在72h時(shí)上調(diào)至最大倍數(shù)9.7和2.8倍,說(shuō)明TLR2、MyD88、HSP70參與了哈維氏弧菌感染的免疫應(yīng)答,此外也說(shuō)明,除了頭腎和脾臟,肝臟和鰓在免疫應(yīng)答過(guò)程中也是重要的檢測(cè)評(píng)價(jià)組織。(4)在甲醛濃度為0.2%,28℃條件下,對(duì)哈維氏弧菌CJG-1株滅活24h,制得全菌滅活疫苗,對(duì)美洲黑石斑腹腔注射0.2ml,1×10~9cfu/ml的疫苗,在0h(免疫前)、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h共9個(gè)時(shí)間點(diǎn),取組織脾臟、頭腎、肝臟、鰓保存在RNA保存液中用于后期熒光定量PCR檢測(cè)TLR2、MyD88、HSP70相對(duì)表達(dá)量。2周后同樣劑量和方式加強(qiáng)免疫一次,第4周進(jìn)行用1×10~8cfu/ml的哈維氏弧菌菌懸液進(jìn)行攻毒。結(jié)果顯示得出TLR2和MyD88在頭腎和肝臟中上調(diào)趨勢(shì)顯著,其中MyD88在36h出現(xiàn)峰值為73.2和95倍,肝臟中的TLR2在24h上調(diào)至最大62.倍,頭腎在36h峰值達(dá)到144.4倍,HSP70在脾臟、頭腎、肝臟、鰓中均在18-48h之內(nèi)表達(dá)量出現(xiàn)峰值,其中頭腎在48h上調(diào)為對(duì)照組的6.2倍,肝臟在18h時(shí)上調(diào)為對(duì)照組的6.6倍;攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示免疫后的美洲黑石斑獲得了較強(qiáng)的免疫保護(hù)力,其相對(duì)保護(hù)率為85.71%,因此,從分子研究角度對(duì)免疫基因表達(dá)分析說(shuō)明TLR2、MyD88、HSP70這3種基因參與到美洲黑石斑免疫應(yīng)答過(guò)程中,良好的免疫保護(hù)率也說(shuō)明疫苗免疫刺激能提高機(jī)體的免疫力,本實(shí)驗(yàn)制備的滅活疫苗對(duì)美洲黑石斑的免疫保護(hù)是有效。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S943
【圖文】：

32圖 5-1 美洲黑石斑感染哈維氏弧菌后脾臟（A）、頭腎（B）、肝臟（C）、鰓（D）中 TLR2 的相對(duì)表達(dá)量Fig.5-1 Expression of TLR2 in spleen(A), head kidney(B),liver(C) and gills(D) 0f Centropristisstriata infected by Vibrio harveyi*表示不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與對(duì)照組之間有顯著性差異（P＜0.5），下同。Therewas asignificant differencebetween the expression at different time points and the controlgroup (P<0.05)，thesameas below.5.7.3 Myd88 在脾臟,頭腎，肝臟和鰓中的表達(dá)脾臟中的 Myd88 在受感染后 6h 迅速上調(diào)為對(duì)照組的 2 倍，在 36h 時(shí)上調(diào)達(dá)到最大為對(duì)照組的 9.3 倍（圖 5-2A）；在頭腎中也是在 6h時(shí)迅速上調(diào)至 2.3 倍，達(dá)到最大值，36h和 72h時(shí)顯著上調(diào)（P＜0.5），其他各時(shí)間點(diǎn)變化不顯著（圖 5-2B）；

除 48h和 96h差異不顯著外，其他各時(shí)間點(diǎn)平均上調(diào)為 2-3 倍（圖 5-2C）；（圖5-2D）中可以看出，24-48h內(nèi)顯著上調(diào)（P＜0.5），在 36h時(shí)達(dá)到最大，為對(duì)照組的 8.3 倍，其他各時(shí)間點(diǎn)變化不顯著。圖 5-2 美洲黑石斑感染哈維氏弧菌后脾臟（A）、頭腎（B）、肝臟（C）、鰓（D）中 Myd88的相對(duì)表達(dá)量Fig.5-2 Expression of MyD88 in spleen(A), head kidney(B),liver(C) and gills(D) 0fCentropristis striata infected by Vibrio harveyi5.7.4 HSP70 在頭腎，肝臟，脾臟和鰓中的表達(dá)從圖5-3A可以看出，HSP70在脾臟中的相對(duì)表達(dá)量及變化情況，受到感染后，6h表達(dá)量顯著升高（P＜0.5）

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡靜;吳開(kāi)暢;葉樂(lè);王雨;;急性鹽度脅迫對(duì)克氏雙鋸魚(yú)幼魚(yú)過(guò)氧化氫酶的影響[J];南方水產(chǎn)科學(xué);2015年06期

2 關(guān)建義;毛會(huì)麗;賀文旭;楊利敏;符運(yùn)棟;張敬梅;吳佳靜;寧黔冀;;豫北地區(qū)嗜水氣單胞菌滅活疫苗的制備及免疫效果的研究[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2015年11期

3 張潔;鄭津輝;李慶亞;耿緒云;孫金生;潘寶平;孫世南;高虹;;牙鲆(Paralichthys olivaceus)TLR21基因在遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的表達(dá)特征[J];海洋與湖沼;2015年06期

4 李曉萌;戴偉;方珍珍;邢克智;王慶奎;陳成勛;;3種非特異性免疫相關(guān)基因在點(diǎn)帶石斑魚(yú)組織中的mRNA表達(dá)分析[J];天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);2015年01期

5 張艷亮;彭士明;高權(quán)新;張晨捷;施兆鴻;;飼料維生素E水平對(duì)云紋石斑魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)及免疫指標(biāo)的影響[J];海洋漁業(yè);2015年02期

6 崔婧;范雪亭;劉文竹;李紅月;周永燦;王世鋒;謝珍玉;;華南地區(qū)海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)主要弧菌病原的分離與鑒定[J];海南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年03期

7 孫鵬;柴學(xué)軍;尹飛;胡則輝;朱云海;王躍斌;;運(yùn)輸脅迫下日本黃姑魚(yú)肝臟抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)[J];海洋漁業(yè);2014年05期

8 徐曉麗;邵蓬;李灝;任涵瑋;張勤;;豹紋鰓棘鱸致病性哈維氏弧菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年04期

9 宋曉青;邢婧;戰(zhàn)文斌;;牙鲆經(jīng)注射和浸泡免疫鰻弧菌滅活疫苗后7種免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化[J];中國(guó)水產(chǎn)科學(xué);2014年04期

10 王玉堂;;疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的作用及應(yīng)用前景(連載一)[J];中國(guó)水產(chǎn);2013年03期

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